陈晓超 王 友 崔文明 李伟松 刘树滔* 饶平凡

    (1福州大学生物科学与工程学院 福州 350108

    2浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州 310018)

    超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于自然界一切生物体内，它能够催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，减轻或消除超氧阴离子自由基对生物体的氧化或过氧化损伤[1]。大量的前期研究表明，生物体的衰老、病变及辐射损伤等都与自由基在体内的形成密切相关，而SOD作为自由基清除剂具有抗衰老、抗炎症、抗辐射、抗自身免疫疾病和抑制肿瘤等生理功能[2-4]。人体中的超氧化物歧化酶有 3 种：Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和EC-SOD。其中Cu，Zn-SOD在人体肝脏和大脑中含量最高，它以二聚体的形式存在于细胞质中[5]。作为人体关键的抗氧化酶类之一，SOD被广泛应用于医药、保健品、食疗和护肤美容等领域[6-8]。

    迄今为止，国内各研究单位已成功利用不同原核生物系统大量表达重组人源SOD蛋白，例如在大肠杆菌和毕赤酵母发酵体系中成功构建与表达人源Cu，Zn-SOD[9-12]，并应用于相关的抗放化疗辐射[13-14]、抗紫外线辐射[15-16]、抗脑缺血再灌注损伤[17]、皮肤创伤修复[18]等研究。然而，将基因重组技术制备的Cu，Zn-SOD应用于各种疾病的治疗，首先必须解决的问题是如何去除工程菌在发酵表达重组蛋白质过程中所造成的大量内毒素污染。如果未能解决这一关键纯化问题，后续的一系列临床前功能评价试验与潜在的临床应用都无法开展。

    细菌内毒素是一种脂多糖，主要来源于革兰氏阴性菌的细胞壁，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素[19-20]。内毒素是一种毒性极强的致炎和热原物质，极微量内毒素进入人体内，就会引起高热、腹泻、血管扩张，甚至休克或死亡[21]。对于非胃、肠道给药制剂中去除内毒素，始终是一项极其重要的任务[22]。目前常用的去除内毒素的方法有膜过滤/超滤、活性炭吸附、柱层析/离子交换色谱或亲和色谱法等多种[21，23-24]。本文采用活性炭吸附和Triton X-114萃取两种方法去除重组蛋白溶液中内毒素，通过对比二者在内毒素去除效率和重组蛋白回收率两个关键参数，确定适合于大批量处理重组Cu，Zn-SOD蛋白溶液中内毒素的最适工艺路线。本研究的目的在于有效清除重组蛋白溶液中的内毒素，并保证目标蛋白在纯化过程中高回收率，使纯化后蛋白溶液的内毒素含量能够达到药典中要求的注射剂的质量标准，完全可以应用于保健食品的开发。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器 ......