宋明辉 施春雷 李琼琼 史贤明 杨美成*

    (1 上海市食品药品检验所 国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室 上海201203 2 上海交通大学农业与生物学院 上海200240)

    金黄色葡萄球菌是一种重要的食源性致病菌，由其引起的食物中毒是一个世界性卫生问题，对公共健康和食品安全带来巨大威胁[1]。2011年，我国卫生部根据致病菌风险评估结果，参照国际食品微生物标准委员会采样方案和限量规定，对食品安全国家标准 《速冻面米制品》(GB 19295-2011)进行了修订，其中金黄色葡萄球菌由不得检出调整为限量检出[2]。2013年实施的致病菌限量通用标准GB 29921-2013 也将预包装食品(不适用罐头类食品) 中的金黄色葡萄球菌检测修订为限量检出[3]。虽然国家对食品安全标准进行了调整，但配套的金黄色葡萄球菌定量检测方法仍为传统的平板培养法。该方法不仅耗时久(至少4～5 d)，而且操作繁琐，不能满足当前对食品快速风险评估的要求。

    荧光定量PCR(qPCR)技术和传统培养方法相比，在检测时间、灵敏度、成本以及高通量方面都具有很大优势，可实现对致病菌快速定性、定量检测[4-5]。然而，直接应用qPCR 技术检测食品中污染的致病菌时，无法区分活菌与死菌。研究表明：在细菌胁迫条件下保藏的食品会造成致病菌失活[6]，如速冻食品，因此采用qPCR 技术检测时，无法准确定量食品中污染的致病菌。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA) 是一种具有高亲和力的光敏反应DNA 结合染料，它可与qPCR 联合使用，选择性扩增活细胞中的DNA，提高检测的准确性[7-9]。此外，对于PCR 检测技术，检测靶点的特异性对于致病菌准确检测格外重要。由于靶序列变异、基因水平转移等因素，往往会导致假阴性、假阳性等误检结果[10]。检测靶点的特异性和数量限制了基于核酸检测致病菌的能力，因此不断发掘新的特异检测靶点势在必行。

    金黄色葡萄球菌肠毒素A 被认为是引起食物中毒的最主要致病因子，90%以上的食物中毒菌株都携带肠毒素sea 基因[11-12]。与大部分肠毒素不同，肠毒素A 不受群体感应系统调控，在细菌数目较低时也能产生肠毒素，而且94 ng 的肠毒素A就能导致食物中毒[13-14]。在允许食品中较低数目金黄色葡萄球菌存在的同时，有必要对食品中肠毒素sea 基因进行检测，来评估食品中污染肠毒素A的风险。此外，食品基质、DNA 提取过程中残留的有机酸及其它多种因素均可抑制PCR 反应，造成假阴性结果。在检测体系中添加扩增内标可有效指示检测过程中出现的假阴性结果 ......