袁巧敏，卢海强，黄 蕾，谷新晰，李 晨，田洪涛，2*

    (1 河北农业大学食品科技学院 河北保定071001 2 国家北方山区农业工程技术研究中心 河北保定071001)

    我国已经明文禁止有机磷中的甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、磷胺、久效磷等剧毒、高毒农药用于果蔬的病虫害防治，而有些果农、菜农及相关企业仍使用这些有机磷农药对害虫进行防治[1]。因过量使用或滥用农药而导致的农药残留及急慢性中毒事件屡见不鲜，故做好农药残留的检测，进而保证食品安全刻不容缓[2]。

    基于乙酰胆碱酯酶(achetylcholinesterase，AchE)的酶抑制分析方法(简称酶法)快速、简便，尤其是检测成本低，适宜基层大面积现场筛查的需要，是对大型仪器检测方法的补充[3-4]。其中，核心原材料——AchE 的制备是关键，也一直备受研究者的关注。相比从动植物中分离提取，采用基因工程技术进行重组AchE 的制备是未来的发展方向[5]。

    自Schumacher 等[6]首次从电鳐克隆得到AchE 的cDNA 以来，研究者已从鼠、鲤鱼、果蝇等生物体内获取了AchE 的cDNA，并开展重组AchE 的表达研究[7-9]。毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种真核表达系统，除了能对外源蛋白进行翻译后的加工修饰外，还能使产物有效分泌，培养方便、经济[10]。目前国内外有多种昆虫ache 基因利用毕赤酵母系统得到很好的表达。例如，Zhou 等[11]利用该系统表达了重组东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶；卢临萍[12]利用该系统表达了家蚕乙酰胆碱酯酶；曹雪等[13]利用该系统大量表达了中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶。

    鉴于毕赤酵母表达系统的优势及应用前景，本试验通过序列分析并根据毕赤酵母密码子偏好性，对家蝇乙酰胆碱酯酶基因进行密码子替换，构建分泌表达载体pPIC9K-mdAchE，进而实现重组酶mdAchE 在毕赤酵母 GS115 中的高效表达，为进一步将mdAchE 应用于有机磷及氨基甲酸酯类农药残留检测提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    巴斯德毕赤酵母GS115 和质粒pPIC9K，由本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞Trans 1-T1，购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶和限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ，购自TaKaRa 公司；质粒小提中量试剂盒和DNA 回收试剂盒，购自Biomiga 公司；8 种有机磷农药(100 μg/mL)和8 种氨基甲酸酯类农药(100 μg/mL) ......