徐蕾蕊，李 丹，魏咏新，马 丹，魏海燕，汪 琦，张西萌，付溥博，刘 莉，赵晓娟，曾 静

    (中国海关科学技术研究中心 北京100026)

    1975年Appleton 等[1]在肠胃炎患者粪便中首次发现HAstV，其为一种无衣壳的单股正链RNA病毒，具有5～6 个小角，呈星星状。星状直径28～35 nm，基因组全长6.8 kb，包含5’非编码区(Noncoding region，NCR)和ORF1a、ORF1b、ORF2 共3个开放阅读框。HAstV 分为8 个血清型，其中，可在婴幼儿、年长者和免疫低下人群中引起严重的急性病毒性肠胃炎的血清型是人星状病毒1 型(Human astrovirus type1，HAstV-1)[2]。

    食源性病毒的感染剂量非常低，10～200 个病毒粒子即可引起感染，在人体肠道中经过繁殖后，通过粪便污染环境，并进一步通过受粪便污染的水或者淤泥、土壤等诸多途径传播[3]。鉴于此，需要提高HAstV 检测的灵敏度和准确度，建立一种简便易操作的食品中HAstV 定量检测方法，对食品中HAstV 污染水平实现有效监控。本研究应用RT-ddPCR，建立了一种快速、简便定量检测食品中HAstV 的方法，为开展食品中HAstV 等食源性病毒暴露评估工作提供新的技术手段。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂与仪器

    HAstV、轮状病毒、诺如病毒、甲肝病毒RNA，本实验室保存；MS2 噬菌体悬液，本实验室保存；pcDNAⅡ载体，美国Invitrogen 公司；焦碳酸二乙酯(Diethyl paracabonate，DEPC)处理H2O，北京天根生化科技有限公司；总RNA 抽提试剂Trizol，美国Invitrogen 公司；乙醇、异丙醇、氯仿、异戊醇，北京化学试剂公司；核糖核酸酶抑制剂(Recombinant RNasin?ribonuclease inhibitor)，美国Promega 公司；一步法定量实时荧光聚合酶链式反应试剂盒(SuperScript?ⅢPlatinum?one-step quantitative RT-PCR system)，美国Invitrogen 公司；病毒核糖核酸提取试剂盒(QIAamp viral RNA mini kit)，德国QIAGEN 公司；蛋白酶K，天根生化科技(北京) 有限公司；核糖核酸磁珠纯化试剂盒(Dynabeads?mRNA purification kit)，美国Life Technology 公司；微滴生成油 ......