方若思，陈唐超，梁淑敏，金诚豫，黄温迪，龚金炎，肖功年

    (浙江科技学院 杭州310023)

    氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)是一种在动物乃至人体内具有潜在致癌性的2A 类致癌物，存在于多种发酵食品及酒精饮料中，如酱油、奶酪、葡萄酒、黄酒等[1-3]。研究表明，尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸和焦碳酸二乙酸是EC 形成的前体物，其中酵母菌和部分乳酸菌通过精氨酸代谢途径产生的尿素和瓜氨酸是最重要的2 种前体物[4]。

    酒类的瓜氨酸主要自精氨酸脱亚胺酶途径代谢产生，在这一途径中包括3 种关键酶，分别为精氨酸脱亚胺酶 (Arginine deimidase，ADI，EC3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶 (Ornithine transcarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(Carbamate kinase，CK，EC2.7.2.2)[5-7]。该途径将精氨酸水解，最终转化为鸟氨酸、氨和二氧化碳。

    目前关于鸟氨酸氨甲酰转移酶的研究较少，主要集中在人体内，由于是肝脏尿素循环的必需酶，因此OTC 酶的缺失常导致嗜睡、呕吐、精神发育迟缓等症状，同时OTC 的缺失与否也可作为肝细胞癌的早期诊断指标之一[8-9]。根据之前的研究发现，OTC 与氨基甲酸乙酯的形成呈负相关性[10-11]，即OTC 的表达对EC 的形成有抑制作用，然而OTC 与EC 的直接关联性未见研究报道。

    短乳杆菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，在含碳水化合物的动物、植物发酵产品以及温血类动物的消化系统中十分常见，作为一般认为安全(Generally recognized as safe，GRAS) 的食品级微生物，在食品、工业、农牧业及医药等领域中亦拥有重要的应用价值[12]。挖掘益生性乳酸菌源的酶类是目前人们的关注点之一。

    本研究以短乳杆菌中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶为对象，通过基因克隆表达手段和Ni-NTA 纯化方法，获得大量高纯度的OTC 酶，在黄酒发酵的不同阶段直接添加到酒体中，研究其与EC 之间的相互作用，为挖掘其潜在的工业应用价值奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和质粒pET-28a 由本实验室保存，大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，全试金公司。

    细菌基因组提取试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒、PCR 产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA 琼脂糖树脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鸟氨酸、茚三酮、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan) ......