卢海强，陈 伟，黄 蕾，谷新晰，田洪涛

    目前，有机磷类 (organophosphorus insecticides，OPs)和氨基甲酸酯类(carbamate insecticides，CBs)农药的不合理使用已严重威胁到农产品的质量安全[1-3]。如何快速、灵敏及低成本的检测农副相关产品的农药残留，对于保障我国的食品安全具有重要的现实意义。目前测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法主要有3 类，分别是色谱法[4]、免疫法[5]和酶抑制法[6]。其中酶抑制剂法检测成本较低，可用于农副产品生产的现场检测，成为最有发展潜力的检测方法，而乙酰胆碱酯酶是酶抑制法的核心材料。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，E.C.3.1.1.7)是生物神经传导中的关键酶，也是有机磷和氨基甲酸酯类农药作用的靶位点[7-8]。当前，酶抑制剂法推广的瓶颈主要是较高的酶制剂生产成本及酶对有机磷农药所表现出的较低的敏感性。

    一般来说，酶制剂发展可分为3 个阶段：第1阶段是酶制剂主要从动物、植物和微生物体中直接提取[9-10]；第2 个阶段是利用基因工程技术实现酶基因的高效表达，摆脱原材料的束缚，降低酶的生产成本[11-12]；而第3 个阶段主要是对酶制剂分子进行改造，使它的催化效率、稳定性及酶学性质向着有利于实际应用需求的方向改变，称为酶的分子进化[13]。目前，乙酰胆碱酯酶处于第1 阶段发展末期和第2 阶段初期的过渡阶段，即大量的乙酰胆碱酯酶主要从生物体直接提取获得，而该类方法获得乙酰胆碱酯酶产量低、成本高，难以满足检测的需要。目前，众多科研工作者对多种物种如鱼、家蚕和菜叶蛾等来源的乙酰胆碱酯酶基因进行克隆表达[14-16]，发现它们对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性存在较大差异，其中鱼源乙酰胆碱酯酶表现出较好的应用潜力[17-18]。2009年，Sato等[19]选用pPICZα A 载体和P.pastoris X-33 宿主完成了对鲤鱼来源的乙酰胆碱酯酶基因的克隆表达，然而，酶的表达量偏低(181 mU/mL ± 31 mU/mL)。2019年，Liang[20]等采用细胞表面展示技术对CpAChE 进行研究，取得较好的效果，然而，该酶表达量不高的问题依然制约其在食品农药残留检测中的应用。

    本研究以鲤鱼乙酰胆碱酯酶基因(CpAChE)为研究对象，依据毕赤酵母的密码子偏好性对该基因进行密码子优化，获得乙酰胆碱酯酶优化基因CpAChEopt。采用pPIC9K 及毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 表达系统进行高效表达 ......