谭 颖，陈晓倩，付恒芳，朱旭萌，李 春，刘丽波

    (东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 哈尔滨 150030)

    双歧杆菌在人肠道中发挥重要作用，与人体的正常代谢及健康密切相关。而黏附是长双歧杆菌定植于肠道发挥作用的前提[1-7]。深入研究长双歧杆菌的黏附能力尤为重要，只有弄清其黏附机制，才能改善在人体肠道的定植状况。

    目前报道的双歧杆菌黏附基因有BopA、Serpin、slpA、bif 等。Guglielmetti 等[8]从双歧杆菌MIMBb75 中分离纯化出对caco-2 具有黏附作用的BopA 蛋白。Jakava-Viljanen 等[9]从双歧杆菌ATCC8287 中筛选出slpA 表面黏附蛋白。Schell等[10]筛选出与黏附相关的Serpin 黏附蛋白。bif 黏附蛋白是Fujiwara 等[11]在长双歧杆菌SBT2928 中发现的，并证明bif 黏附蛋白不仅具有黏附作用，而且对致病菌的黏附能力有抑制作用，其对产志贺氏菌毒素大肠杆菌的抑制作用达到50%。bif 基因总长为1 059 bp，经NCBI 数据库分析其为长双歧杆菌NCC2705 编号58012118 的序列[12]。

    本试验旨在构建长双歧杆菌bif 基因缺失菌株，验证长双歧杆菌bif 黏附基因的黏附性能。较为常见的基因敲除方法为插入失活、RNA 干扰以及同源重组[13-15]。孙金威等[16]利用同源重组方式成功敲除了保加利亚乳杆菌的ccpA 基因序列。本试验以同源重组方式敲除长双歧杆菌bif 黏附基因，为进一步研究长双歧杆菌bif 基因的黏附作用奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    长双歧杆菌C16，实验室自备菌株；感受态细胞大肠杆菌(E.coli)DH5α，维地生物；质粒pMD19-T simple Vector、质粒PUC18，北京宝易生物有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；DNA 纯化回收试剂盒，北京天根生化科技有限公司；2×Taq Mater Mix、2×Fast Pfu Mater Mix、λ/Hind Ⅲ DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DNA ladder2000 Marker、T4DNA 连接酶，北京宝易生物有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、PstⅠ，北京宝易生物有限公司；四环素、氨苄青霉素，Amresco 公司。

    1.2 设备与仪器 ......