黄 蓉， 董 超， 余鸿飞， 秦 义， 刘延琳， 宋育阳

    (西北农林科技大学葡萄酒学院 陕西杨凌712100)

    酸性蛋白酶是一种具有丰富的化学和物理性质的天冬氨酸蛋白酶， 其活性位点中心含有一个或更多的羧基，能够在酸性介质(pH<4.5)中有效地水解蛋白质[1]。 这类酶具有极强的耐酸性，在水解过程中不会因微生物的滋生繁殖而腐败变质，普遍应用于食品、 酿造等各个工业的蛋白水解过程中[1-3]。大量的真菌可分泌产生酸性蛋白酶，有研究表明担子菌也可分泌产生酸性蛋白酶[4]，分泌酸性蛋白酶的原核生物比较罕见[5]。依据活性位点上官能团的差异，蛋白酶通常被分为4 种类型：含硫类氨基酸Cys 的蛋白酶， 富含羟基类氨基酸Ser的蛋白酶， 富含酸性氨基酸Asp 的蛋白酶和金属蛋白酶[6]。对于天冬氨酸(Asp)蛋白酶而言，其等电点大致为3.0～5.0 且分子质量大约是30～40 ku，最大的酶活性体现位于酸性介质中[7-8]，被称为酸性蛋白酶。

    啤酒、 白酒和酱油等的酿造常用酸性蛋白酶作为蛋白澄清剂。在啤酒发酵糖化阶段，利用酸性蛋白酶可降解底物麦芽中的蛋白质， 通过添加适量的酸性蛋白酶阻止啤酒遇冷浑浊的现象[9]。有研究报道在白酒酿造过程中， 酸性蛋白酶可以溶解发酵原料和辅料的成分，促进酒精发酵，同时降解微生物残体，赋予白酒香气物质[10-11]。 蛋白质与其它物质形成的复合物是组成葡萄酒的物理、 化学特性的重要指标[7，11]，然而白葡萄酒中来自发酵原料和辅料的非稳定蛋白质， 会对葡萄酒的香气和感官特性造成不良影响[12]。 针对白葡萄酒蛋白沉淀问题， 传统方法是在发酵或陈酿过程使用明胶和膨润土，虽可去除蛋白沉淀，但下胶过程会将葡萄酒中部分稳定性蛋白去除[12]，影响葡萄酒的香气质量。 使用蛋白质酶解法可将葡萄酒中蛋白质水解成小肽[9]，同时对酒液补充部分氨基酸，使葡萄酒获得良好的澄清度和稳定性， 提高葡萄酒的营养价值[10，13]。 目前可利用分子生物学发展的平台，通过基因工程改造酵母菌，使其分泌酸性蛋白酶，在发酵过程中水解不稳定的蛋白质，达到改善白葡萄酒的感官品质，解决蛋白沉淀的目的。

    本研究以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)为酸性蛋白酶基因(pepA)供体，采用酵母细胞表面展示技术，将宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因pepA整合到酿酒酵母的基因位点， 以期在酿酒酵母发酵的过程中， 将不稳定蛋白质水解成氨基酸和小肽， 旨在解决白葡萄酒中蛋白浑浊的问题同时为酵母的生长提供可吸收性氮源。

    1 材料与方法 ......