王 谦，焦熙栋，闫博文，孟令璐，曹洪伟，黄建联，赵建新，张 灏，陈 卫，范大明

    (1 江南大学食品科学与技术国家重点实验室 江苏无锡 214122 2 农业农村部冷冻与调理水产品加工重点实验室 福建厦门 361022 3 江南大学食品学院 江苏无锡 214122 4 福建省冷冻调理水产品加工重点实验室 福建厦门 361022 5 福建安井食品股份有限公司 福建厦门 361022)

    中国淡水鲢鱼资源丰富，以鲢鱼肌肉为原料加工的鱼糜制品因高蛋白和低脂肪等特点而消费前景看好。在鱼糜加工过程中大多出现凝胶劣化现象，鱼肉被内源性蛋白酶降解，导致鱼糜凝胶强度低、口感差等问题[1]，其中淡水鱼糜制品的凝胶劣化现象相较于海水鱼更为严重[2]。大多数研究认为肌纤维结合性蛋白酶是鱼糜凝胶劣化现象的主要诱因，因为其与蛋白结合紧密，在鱼糜加工过程中不易去除[3]。其中，组织蛋白酶L(EC 3.4.22.15)因水洗后残留活性高、热稳定性强、抗冻性强和具有广泛的底物特异性等特征而备受关注[4-6]。目前研究大多通过分子克隆手段获得组织蛋白酶L，此方法难度较大，尤其是异源蛋白的表达受多种因素影响，从而间接影响酶的活性和结构[7]。市售组织蛋白酶L 大多来源于哺乳动物，而鱼类与哺乳动物组织蛋白酶L 的同源性较差，白鲢组织蛋白酶L 的基因片段尚未被鉴定，针对鲢鱼组织蛋白酶L 的分子克隆研究极少。有必要对白鲢的内源性组织蛋白酶L 进行分离纯化，为研究抑制鱼糜凝胶劣化方法提供依据。

    由于组织蛋白酶L 含量较少且其和肌肉结合紧密性强，现有的纯化方法大多采用阴离子交换层析、分子筛层析、阳离子交换层析和染料亲和层析组合的多步层析法来保证其纯度，然而此法步骤繁杂，耗时长且回收率低[8]。本文在现有组织蛋白酶L 分离纯化方法的基础上，优化酸处理、盐析和透析等分离步骤，建立弱阴离子交换和分子筛两步层析法，作为一种分离纯化鲢鱼组织蛋白酶L 的新型方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    活白鲢(每条1 500～2 000 g)，购买于附近超市，击晕宰杀后装冰速运至实验室待用；蛋白纯化层析柱 HiTrap SP HP、HiTrap Q HP、HiTrap DEAE FF (1.6 cm×2.5 cm) 和HiLoad16/600 Superdex 75 pg(1.6 cm×60 cm)Cytiva(思拓凡)，原通用电气医疗生命科学事业部；荧光合成底物ZPhe-Arg-MCA 和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，美国sigma-aldrich 西格玛奥德里奇公司；Bradford蛋白测定试剂盒 ......