崔方超，王芸婷，王当丰，檀茜倩，李秋莹，励建荣*，李婷婷

    (1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心中国轻工业海水鱼加工重点实验室 辽宁锦州121013 2 大连民族大学生命科学学院 辽宁大连 116600)

    实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)因特异性强、灵敏度高、定量准确、高通量、操作简便等优点，而被广泛应用于基因表达的研究中[1]。qPCR 检测基因表达水平的定量方法分为绝对定量和相对定量。相较于相对定量法，使用绝对定量法需要构建不同梯度稀释的标准品并绘制标准曲线来计算目的基因模板的起始量，操作更为繁琐且增加了试验难度[2]。因此，在使用qPCR 检测基因表达水平时大多采用相对定量法，通常需要引入一个在不同样本内表达稳定的基因作为内参基因，从而校准目的基因的表达量[3]。常用的内参基因有GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、ACT(肌动蛋白)、TUB(微管蛋白)、His(组蛋白)、16S rRNA(16S 核糖体RNA)等。大量研究表明，上述内参基因有可能因物种、生长阶段或发育条件的不同而表达不稳定，因此，需要根据试验条件选择能够稳定表达的内参基因来保证qPCR 结果准确可靠[4-6]。

    荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)属于革兰氏阴性需氧杆菌，具有脂解和蛋白水解活性，是奶类[7]、水产品[8]、肉制品[9]等食品在冷藏条件下的优势腐败菌。荧光假单胞菌能产生生物被膜、胞外蛋白酶、嗜铁素等多种致腐因子，导致食品腐败变质，分泌酮类、醛类、醇类等多种挥发性有机化合物，散发令人不快的气味[8，10-11]。作为常见的致病性嗜冷菌，荧光假单胞菌对环境适应力强，其产生的蛋白酶和脂肪酶极其耐热，这不仅缩短了食品的货架期，还有可能危害到人体健康。研究表明，荧光假单胞菌的腐败特性如生物被膜的形成、胞外蛋白酶的分泌等受群体感应(Quorum sensing，QS)系统的调控[12]。QS 系统是一种细菌通讯机制，微生物通过信号分子监测群体密度并激活相关基因表达来调节其生理行为以适应环境变化[13]。近年来以荧光假单胞菌等腐败菌的QS 系统为靶标来调控其腐败特性已成为研究热点[14-16]。通过致腐因子的表征和腐败基因的表达来探索食品腐败机制，其中对腐败基因表达水平的检测大多采用qPCR 技术，大部分都以16S rRNA 作为内参基因。目前内参基因的筛选分析多围绕动物与植物，对微生物内参基因的研究较少，尚未有有关荧光假单胞菌在QS 方面内参基因筛选方面的研究报道 ......