瑞芬太尼预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究(2)
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2009年12月1日
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【Keywords】Remifentanil;Ischemicalreperfusioninjury;Genechip;Genediagnosis
近年来,随着心脏外科手术和介入治疗技术的进展,心肌缺血再灌注损伤成为困扰临床医生的难题。瑞芬太尼作为一种新型超短效阿片类镇痛药在围术期日益得到广泛的运用。因此探讨瑞芬太尼在心肌缺血再灌注损伤保护作用具有重要意义。本课题以SD大鼠建立急性心肌缺血再灌注损伤在体模型,研究不同剂量瑞芬太尼对心肌缺血再灌注损伤保护作用机制。
1材料与方法
1.1材料①动物:80-100d鼠龄SD雄性大鼠40只,体重300±20g(南京市江宁区青龙山动物繁殖场,合格证号:SCXK(苏)2006-018:)。②药品和试剂:盐酸瑞芬太尼(瑞捷1mg/支,粉剂,批号601103)购自宜昌人福药业有限公司;ATP酶测试盒购自南京建成生物研究所;信号转导通路发现者基因芯片、TrueLabeling-AMP线性RNA扩增试剂盒、SuperArrayArrayGradecRNA纯化试剂盒购自美国SuperArray公司。③仪器:DW-2000动物人工呼吸机由上海嘉鹏科技有限公司制造;Spacelab监护仪和Medlab生物信号处理系统由南京美易公司制造;TGL-低温高速离心机由汉萨科学仪器有限公司制造;XHF-1高速分散器由上海金达生化仪器厂制造。
1.2方法
1.2.1在体MIR模型建立
SD大鼠禁食12h,腹腔内注射5%戊巴比妥钠40mg•kg-1麻醉,仰位固定,连接心电图Ⅱ导联于Medlab生物信号记录处理系统;切开气管,行气管插管,接WG-2000型小动物呼吸机(上海)人工呼吸(频率60beat•min-1,潮气量20ml•kg-1)。;股静脉切开置管用于输液和给药(或尾静脉、右颈内静脉置管)。沿左锁骨中线切开皮肤2cm,在4、5肋间打开胸腔,剪开心包,挤出心脏,于左冠状动脉前降支距主动脉根部2～3mm处用4～0丝线穿过动脉备用。稳定15min后,放一横置硅胶管打结结扎,心电图出现J点抬高或为单相曲线者为成功模型。结扎30min后,剪开线结再灌注45min。
1.2.2实验分组和给药
40只SD大鼠随机分为5组,每组8只。对照组:丝线穿过左冠状动脉前降支,但不结扎;缺血再灌注组(MIR组):穿线后等心电稳定15分钟,结扎血管30min后松开线结,再灌注45min;瑞芬太尼预处理各组:于MIR前静注瑞芬太尼(RPC1浓度3μg•kg-1•min-1,RPC2浓度6μg•kg-1•min-1RPC3浓度为12μg•kg-1•min-1,瑞芬太尼用生理盐水溶解)15min,其余同MIR组。
1.2.3心肌匀浆制备
再灌注结束立即取出心脏,用预冷的生理盐水冲去血渍,去除心房及右心室。取心尖部缺血区心肌组织,称重约0.2g心室肌与预冷的匀浆介质1:9混合(匀浆介质组成:Tris1.21g•L-1、EDTA-Na237.23mg•L-1、蔗糖34.2g•L-1、再以HC1滴定至pH值为7.4),在玻璃匀浆器中研磨制成l0%的混悬液,以2000r•min离心10min,取上清液放置-20oC冰箱中低温保存,检测心肌组织Na+/K+-ATP酶活性以及Ca2+-Mg2+-ATP酶。
1.2.4心肌组织基因检测
再灌注结束立即取出心脏,用预冷的生理盐水冲去血渍,去除心房及右心室。取心尖部缺血区心肌组织,称重约0.1g心室肌(在10min内),立刻放入液氮中(-70℃)或-70℃冰箱保存,冻存心肌组织放入干冰中直接运输(2天以内)。取适量(50-100mg)冻存组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA至用不含核酸酶的水溶解,然后加入350μl裂解结合缓冲液,再在样品中加入350μl70%乙醇,混合均匀,上结合柱,离心,用前洗涤缓冲液洗涤一次,用洗涤缓冲液洗涤2次,最后用不含核酸酶的水洗脱,获得适用于芯片分析的RNA。紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度,使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。采用SuperArray公司的TrueLabeling-AMP。线性RNA扩增试剂盒合成生物素标记的cRNA探针,首先把样品RNA进行逆转录反应合成cDNA,在逆转录反应液中加入RNA扩增缓冲液,生物素标记的UTP和扩增酶类混合液,合成生物素标记的cRNA探针。使用SuperArrayArrayGradecRNA纯化试剂盒纯化cRNA探针,将纯化的cRNA探针在GEAhyb杂交液条件下与所选择的信号转导通路发现者基因芯片杂交,cRNA探针与芯片杂交后,加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)及化学发光底物反应,X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果,X射线胶片曝光后,将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。使用配套软件GEArrayExpressionAnalysisSuite对原始数据进行完整的芯片数据分析。
1.2.5心肌病理组织标本制作取左室心尖部缺血心肌组织于4%多聚甲醛溶液中固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明30min,浸蜡3h,切成厚约5mm的切片,作HE染色,中性树胶封片,513T型VANOX多功能显微镜下观察拍照。
1.3统计学处理
计量资料采用x±s表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验,采用SPSS10.0软件包处理,使用配套软件GEArrayExpressionAnalysisSuite对原始数据进行完整的基因芯片数据分析。差异基因表达用组与组之间相对应基因表达的平均标准值的比值表示,比值>2.0或<0.5分别表示上调或下调的差异表达基因。
2结果
2.1MIR大鼠心电变化及瑞芬太尼预处理对其影响与MIR组比较,对照组偶出现室性早博,没有出现室性心动过速和室颤。MIR组于再灌注时出现严重的室性心动过速和室颤,其中部分大鼠心电图可以记录到病理性Q波(图1)。而瑞芬太尼预处理组再灌注性心律失常的发生率明显低于MIR组(表1)。
表1MIR大鼠心律失常发生率及
瑞芬太尼预处理对其影响(x±s,n=8)
与缺血再灌注组相比,△P<0.01;与假手术对照组相比,*P<0.01
2.2MIR大鼠心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化及瑞芬太尼对其影响
与对照组相比,MIR组心肌细胞膜Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性明显降低(P<0.01)。与MIR组相比,瑞芬太尼可以明显恢复细胞膜Na+-K+ATP酶(瑞芬Ⅰ<0.05,瑞芬Ⅱ,瑞芬ⅢP<0.01)和Ca2+-Mg2+ATPATP酶活性(瑞芬ⅠP<0.05,瑞芬Ⅱ,瑞芬ⅢP<0.01),并且有一定的剂量相关性(r分别为0.676,0.654,P均<0.01)。
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