研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展(1)
【中图分类号】 R552 【文献标识码】 A 【文章编号】1561-5464(2010)-05-0 388-02
【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展 。方法 采用一氧化氮合酶抑制剂复制大鼠先兆子痫模型,通过双抗酶联 免疫吸附法检测血浆及尿液中VEGF含量,应用原位杂交法测定肾小球VEGFmRNA转录水平,利 用免疫组化法检测肾小球VEGF蛋白表达情况。结果 在先兆子痫大鼠中, 尿液中VEGF含量(以尿VEGF/尿肌酐表示)升高且与肾脏局部VEGF的表达强度呈正相关,肾 小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表达均增强,且表达的强度与24h尿蛋白排泄量呈正相关。结论尿液VEGF可能来源于肾脏局部的分泌,肾小球VEGF 可能参与了先兆子痫中大量蛋白尿的产生。
【关键词】 血管内皮生长因子;先兆子痫;蛋白尿
先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因,肾脏损伤所致的大量蛋白尿为其 主要的临床表现。引起肾小球滤过膜通透性增高的原因目前不详。血管内皮生长因子(vasc ular endothelial growth factor,VEGF)是一种强效的增强血管壁通透性的生物活性物质 。有研究表明血浆及胎盘蜕膜局部VEGF水平的改变可能与妊高征的发病有关。但血浆、尿液 VEGF水平与肾脏局部VEGF表达的关系及肾脏局部VEGF的表达与先兆子痫肾损伤的关系至今国 内外尚未有研究。本试验拟通过一氧化氮合酶抑制亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro- arginine,L-NAME)复制大鼠先兆子痫模型[1-2],检测血浆、尿液中VEGF浓度, 观察肾 小球中VEGF的表达及其表达的强弱与24h尿蛋白排泄量的关系,从而探讨VEGF在先兆子痫肾 损伤中的作用。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 L-NAME(美国Sigma公司),VEGF Elisa试剂盒( 北京中山生物有限公司),地高辛标记的VEGFmRNA探针(德国Biognostik公司),VEGF多克 隆抗体(Santa Cruz公司),SABC试剂盒(武汉博士德生物制品公司),大鼠尾动脉袖带式 血压计,透射电镜,计算机病理图像分析仪。
1.2 动物模型复制与分组取200～250g普通级Wista r雄性大鼠50只和成年Wistar 雄性大鼠25只,按雌:雄=2:1比例同笼混合饲养一夜后,次日清晨当雌性大鼠阴道涂片检 查可见活动的精子时,确认为大鼠妊娠第1d。将孕鼠随机分为两组,A组:先兆子痫模型组 (n=6),B组:正常妊娠对照组(n=6)。另取6只无妊娠史雌性大鼠作为C组,即未孕L-NAM E处理组。从妊娠第18d开始对A组和B组大鼠分别皮下注射L-NAME和蒸馏水250mg/(kg/d), 持续4d后于妊娠第22d时处死。C组大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/(kg/d),持续4d后处死 。
, 百拇医药
1.3 24h尿蛋白排泄量的测定 用标 准代谢笼分别与注射前和注射第2、4d收集各组大鼠24h尿液,采用考马斯亮蓝结合法测定24 h尿蛋白排泄量。
1.4 收缩期血压的测定 A组和C组大鼠于L-NAME注射前 及L-NAME注射第2、3、4d 测量尾动脉收缩压。具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至38℃～40℃,待其安静后用大鼠 尾动脉血压仪在5min内连续测量3次收缩期血压,取平均值。
1.5 血浆及尿液标本的采集与检测在注射第4天时经 眼静脉窦采集各组大鼠静 脉血2ml,置于经肝素抗凝的玻璃管,3000r/min离心10min后取上清液,置于-70℃冰箱保存 待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各组大鼠尿液,3000r/min离心10min取上清3ml存放于-70 ℃冰箱保存待检。采用双抗酶联免疫吸附法(ELISA),通过绘制标准曲线求出标本VEGF的 浓度,为了纠正尿液浓度不同的影响,尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐(ng/mmol Cr)来表 达。
1.6 原位杂交法大鼠处死后,取一侧肾组织将其置 于4%多聚甲醛液1～2h、脱 水、透明、浸蜡、包埋、连续切片后,具体操作步骤按VEGFmRNA 原位杂交试剂盒说明书进 行。实验设不加探针的阴性对照。显微镜下胞浆呈黄色颗粒状为阳性。
1.7 免疫组织化学法 VEGF蛋白用免疫组织化学法检测 ,具体操作步骤见试 剂盒说明书。实验均设不加一抗的阴性对照。显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒状者为阳性,蛋白 表达强弱用吸光度(absorbance,A)表示。每张切片随机选取5个肾小球,用免疫组化分析 软件(HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统)计算VEGF阳性着色细胞吸光度。, 百拇医药(王利平)
【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展 。方法 采用一氧化氮合酶抑制剂复制大鼠先兆子痫模型,通过双抗酶联 免疫吸附法检测血浆及尿液中VEGF含量,应用原位杂交法测定肾小球VEGFmRNA转录水平,利 用免疫组化法检测肾小球VEGF蛋白表达情况。结果 在先兆子痫大鼠中, 尿液中VEGF含量(以尿VEGF/尿肌酐表示)升高且与肾脏局部VEGF的表达强度呈正相关,肾 小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表达均增强,且表达的强度与24h尿蛋白排泄量呈正相关。结论尿液VEGF可能来源于肾脏局部的分泌,肾小球VEGF 可能参与了先兆子痫中大量蛋白尿的产生。
【关键词】 血管内皮生长因子;先兆子痫;蛋白尿
先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因,肾脏损伤所致的大量蛋白尿为其 主要的临床表现。引起肾小球滤过膜通透性增高的原因目前不详。血管内皮生长因子(vasc ular endothelial growth factor,VEGF)是一种强效的增强血管壁通透性的生物活性物质 。有研究表明血浆及胎盘蜕膜局部VEGF水平的改变可能与妊高征的发病有关。但血浆、尿液 VEGF水平与肾脏局部VEGF表达的关系及肾脏局部VEGF的表达与先兆子痫肾损伤的关系至今国 内外尚未有研究。本试验拟通过一氧化氮合酶抑制亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro- arginine,L-NAME)复制大鼠先兆子痫模型[1-2],检测血浆、尿液中VEGF浓度, 观察肾 小球中VEGF的表达及其表达的强弱与24h尿蛋白排泄量的关系,从而探讨VEGF在先兆子痫肾 损伤中的作用。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 L-NAME(美国Sigma公司),VEGF Elisa试剂盒( 北京中山生物有限公司),地高辛标记的VEGFmRNA探针(德国Biognostik公司),VEGF多克 隆抗体(Santa Cruz公司),SABC试剂盒(武汉博士德生物制品公司),大鼠尾动脉袖带式 血压计,透射电镜,计算机病理图像分析仪。
1.2 动物模型复制与分组取200～250g普通级Wista r雄性大鼠50只和成年Wistar 雄性大鼠25只,按雌:雄=2:1比例同笼混合饲养一夜后,次日清晨当雌性大鼠阴道涂片检 查可见活动的精子时,确认为大鼠妊娠第1d。将孕鼠随机分为两组,A组:先兆子痫模型组 (n=6),B组:正常妊娠对照组(n=6)。另取6只无妊娠史雌性大鼠作为C组,即未孕L-NAM E处理组。从妊娠第18d开始对A组和B组大鼠分别皮下注射L-NAME和蒸馏水250mg/(kg/d), 持续4d后于妊娠第22d时处死。C组大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/(kg/d),持续4d后处死 。
, 百拇医药
1.3 24h尿蛋白排泄量的测定 用标 准代谢笼分别与注射前和注射第2、4d收集各组大鼠24h尿液,采用考马斯亮蓝结合法测定24 h尿蛋白排泄量。
1.4 收缩期血压的测定 A组和C组大鼠于L-NAME注射前 及L-NAME注射第2、3、4d 测量尾动脉收缩压。具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至38℃～40℃,待其安静后用大鼠 尾动脉血压仪在5min内连续测量3次收缩期血压,取平均值。
1.5 血浆及尿液标本的采集与检测在注射第4天时经 眼静脉窦采集各组大鼠静 脉血2ml,置于经肝素抗凝的玻璃管,3000r/min离心10min后取上清液,置于-70℃冰箱保存 待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各组大鼠尿液,3000r/min离心10min取上清3ml存放于-70 ℃冰箱保存待检。采用双抗酶联免疫吸附法(ELISA),通过绘制标准曲线求出标本VEGF的 浓度,为了纠正尿液浓度不同的影响,尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐(ng/mmol Cr)来表 达。
1.6 原位杂交法大鼠处死后,取一侧肾组织将其置 于4%多聚甲醛液1～2h、脱 水、透明、浸蜡、包埋、连续切片后,具体操作步骤按VEGFmRNA 原位杂交试剂盒说明书进 行。实验设不加探针的阴性对照。显微镜下胞浆呈黄色颗粒状为阳性。
1.7 免疫组织化学法 VEGF蛋白用免疫组织化学法检测 ,具体操作步骤见试 剂盒说明书。实验均设不加一抗的阴性对照。显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒状者为阳性,蛋白 表达强弱用吸光度(absorbance,A)表示。每张切片随机选取5个肾小球,用免疫组化分析 软件(HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统)计算VEGF阳性着色细胞吸光度。, 百拇医药(王利平)