抗Ｎａｖ1．5抗体对豚鼠心室肌细胞钠电流的影响(2)
 |
 |
1.6.1实验分组 将1.5步骤中急性分离下来的豚鼠心肌细胞分别给予不同稀释浓度的抗体(15μg/m1)(室温下)以及利多卡因处理10 min后进行全细胞膜片钳实验。实验分为以下4个组(对照组及三个不同浓度抗体处理组)：(1)1:100抗体稀释组给予0.15/μg/ml抗体处理；(2)1:50抗体稀释组给予0.30μg/ml抗体处理；(3)1:25抗体稀释组 给予0.60 μg/ml抗体处理；(4)对照组未给予抗体处理。
1.6.2记录将急性分离及按上述药物处理后的心室肌细胞放入恒温灌流槽内，用记录INa的电极外液灌流，在倒置显微镜下选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩的心室肌细胞作为实验对象。实验在室温条件下完成。玻璃电极内充电极液后电阻为1-2.5 MΩ，使电极与细胞表面形成高阻封接后破膜，形成全细胞记录模式。补偿电容电流和串联电阻后，通过膜片钳放大器发放刺激冲动，激发的电流信号经AgCl-Ag电极引导，放大器放大，由模数转换器转换为数字信号，储存于计算机硬盘中以备分析。
, 百拇医药
1.7数据处理与统计学分析
膜片钳数据采集及处理由软件pClamp9.2完成，作图由软件Sigmaplot 8.0(sPSS Inc.美国)完成。所有数据均采用均值±标准差(x±s)表示，采用SNK-q检验及Dunnett-t检验(三个抗体处理组与对照组比较)，用SPSS 11.5进行统计学分析，以PNa
峰值的影响
记录钠电流时于细胞外液中加300/μmol/L的CdCl2阻断Lca-lc保持电位-120 mV，给予指令电位从-80-+40 mV，阶跃电压为5 mV，持续时间为15 ms，频率为1 Hz的刺激，记录到钠通道电流(INa)，该电流能被1 mmol/L利多卡因阻断(见图1)。0.15、0.30和0.60 μg/ml抗体分别使INa峰值从对照组的(0.026 296±0.004 436)nA/pF(n=9)降至(0.018 41±0.007 161)nA/pF(P=0.006，n=10)、 (0.013 484±0.002 933)nA/pF(P=0.000，n=9)和(0.012 738±0.004 554)nA/pF(P=0.000，n=8)，见图1。但三个不同浓度抗体处理组之间的差异并无统计学意义(P=0.063)。
, 百拇医药
2.2抗Nay1.5抗体对豚鼠心室肌细胞INaI-V
曲线的影响
如上述记录INa以峰电流(nA/pF)对测试电压作图，即得I-V曲线。INa激活电位为-70 mV，最大峰电位为-35mV，翻转电位为0 mV。0.30μg/ml抗Nav1.5抗体使I-V曲线明显上移，对激活电位、峰电位和翻转电位无明显改变。见图2。图2抗Nav1.5抗体对豚鼠心室肌细胞INa的I-V
曲线的影响
3 讨论
钠通道因其a亚基的不同氨基酸序列被分为10个亚型(Nay1.1至Nav1.9和Nax)，但是它们的氨基酸序列仍具有高度同源性。Keizer等发现一种新的μ-芋螺毒素——SmⅢA，因其具有与其他μ-芋螺毒素不同的结构特征，比如羟脯氨酸的缺失以及其c-末端氨基酸残基的不同等，而成为第一个TTX不敏感性电压门控钠通道(Nav1.5、Nav1.8和Nav1.9)的特异性拮抗剂，近来发现的sⅢA也有相似特性。McNuhy和Hanck。发现一种T型钠通道阻滞剂米贝拉地尔可以阻滞表达于人胚肾细胞中的Nav1.5、Nav1.4、Nav1.2和Nay1.7通道，对其产生慢失活期和使用/频率依赖性阻断。但是，仍然缺乏有效的亚型特异性拮抗剂将Nav1.5从其他具有高度同源氨基酸序列的亚型中分辨出来。
, http://www.100md.com
到目前，已知有很多种毒素和药物能与钠通道a亚基结合从而发挥其阻断剂效应。根据其与a亚基结合部位的不同可分为6类。TYX、海藻毒素(sTX)及μ-芋螺毒素等通过结合于SS1-SS2片段阻塞通道孔而抑制传导；藜芦定、箭毒蛙碱和乌头碱等结合于I-S6和IV-S6产生持续的激活效应；a-蝎毒素和海葵毒素等结合于IV-S3-S4环从而阻止电压感受器IV-S4的外向运动；β-蝎毒素结合于Ⅱ-S3-s4环使电压感受器Ⅱ-S4持续处于外向运动后的位置；双鞭甲藻神经毒素和深海鱼类的雪卡毒素结合于I-S6和IV-S5产生持续的激活效应；利多卡因及其同源物和一些抗癫痫药物通过结合于通道孔的内表面(即结构域IV-S6片段)而产生静息期和剂量依赖性阻断。这些阻断剂与a亚基结合具有较高的选择性和亲和性，故而被用于钠通道生理功能的研究及其同源物结合位点的探测。既然结合于a亚单位的某个跨膜螺旋可以产生相应的阻断效应，那么针对这些跨膜螺旋的抗体的应用就成为了可能。
本实验所应用的兔抗Nav1.5抗体是英国曼彻斯特大学生理系最新研制出来的亚型特异性抗体。他们套用了一种以通道的第三胞外结构域(E3)为目标靶向的体现抗体特异性的识别模式，从而制备出了Nav1.5的亚型特异性抗体；该抗体结合于Nav1.5通道结构域I S5-s6之间靠近S5的一段特异性氨基酸序列即E3。但是，此Nav1.5-E3抗体对Nav1.5通道功能的作用还不清楚。
, http://www.100md.com
本实验从离子通道水平上研究了此抗体对Nav1.5通道电流的作用。结果表明，该抗体能有效地阻断钠通道，明显减小钠通道电流；随着抗体浓度的增加，其对钠通道电流的阻断程度虽有所增强，但是阻断程度之间的差异并无显著统计学意义(P>0.05)。那么它是否对钠通道其他动力学参数如稳态灭活曲线、灭活后恢复曲线等有影响还有待于进一步探究。
Nav1.5在心脏动作电位的产生及心脏电冲动的传导中起着主要作用(该通道电流占心肌细胞中钠通道电流的92%)，其对心脏功能的重要性也已在对由SCN5A基因突变引起患者出现多种病理表型的众多报告中得到了阐述。该编码基因的突变可能与多种心血管钠通道病病有关，如长QT综合征、Brugada综合征家族性进行性心脏传导障碍、病态窦房结综合征等。因此Nav1.5亚型特异性抗体的出现，使得Nav1.5能从众多的高度同源性亚型中分离出来成为了可能(它的基因特异性如Xu等人所述)，也为对Nav1.5通道基因相关疾病的分子机制及其治疗进行进一步研究提供了一个有力的工具。本研究可望为该抗体对钠通道功能性作用的进一步研究打下一定的基础。
[ 上 页 ], 百拇医药(史钰芳)