抗Ｎａｖ1．5抗体对豚鼠心室肌细胞钠电流的影响(1)
[摘要]目的 了解钠通道亚型特异性抗体——抗Nav1.5抗体对豚鼠心室肌细胞钠电流的影响。方法用急性酶解法获得成年豚鼠单个心室肌细胞，并行随机分组，各组分别给予不同稀释浓度的抗体(15μg/m1)(室温下)处理10 min：(1)1:100抗体稀释组 给予0.15μg/ml抗体处理；(2)1:50抗体稀释组 给予0.30μg/ml抗体处理；(3)1:25抗体稀释组 给予0.60μg/ml抗体处理；(4)对照组(未给予抗体处理)。而后分别进行全细胞膜片钳实验测定钠电流并计算电流密度。数据采用one-way方差分析及SNK检验、Dunnett检验。结果 与对照组相比，三个抗体处理组(抗体浓度分别为0.15、0.30和O.60μg/ml)的，Ivn峰值从对照组的(0.026 296±0.004 436)nA/pF分别降至(0.018 41±0.007 161)nA/pF(Pvn的I-Y曲线上移，激活电位、峰电位和翻转电位无明显改变。三个不同浓度抗体处理组之间的电流密度虽有差异，但差异并无统计学意义(P>0.05)。结论抗Navl.5抗体可抑制心室肌细胞钠电流，但无浓度依赖性。
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[关键词]抗Nav1.5抗体；心室肌细胞；钠电流；全细胞膜片钳技术
电压门控钠通道(Nav)是一种跨膜蛋白，是可兴奋性细胞产生动作电位所必需的，它由a和13亚基构成。其中，编码钠通道a亚基的十种基因已得到鉴定：Nav1.1至Nav1.9及Nax。Nav1.5主要分布于心肌细胞中，由基因scN5A编码，是TTx不敏感性钠通道，能被微摩尔级浓度的TTx阻断；它在心脏动作电位的产生及心脏电冲动的传导中起着主要作用。
Nav1.5对心脏功能的重要性已在对由SCN5A基因突变相关病理表型的众多报告中得到阐述，这说明即使Nav1.5细胞生物学和功能发生微小变化也可能成为人类疾病的发生基础。利用E3靶向作用研制出了亚型特异性抗体——抗Nav1.5抗体，但该抗体对心脏钠通道的功能性作用还不清楚。为此，本实验旨在应用全细胞膜片钳技术，在离子通道水平上考察该抗体对豚鼠心室肌细胞Nav1.5钠通道的影响，为该通道基因相关疾病的分子机制及其治疗的进一步研究打下一定的基础。
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1 材料与方法
1.1 实验动物
豚鼠，雌性，180-250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 实验仪器
膜片钳放大器(Axopateh 200-B，USA)，三维微操纵器(Budeigh，PCS-5000，USA)，倒置显微镜(Axiovertl00，Germany)，玻璃电极拉制仪(Narishige，PC-10，Japan)，玻璃毛坯(内径0.8mm，外径1.8 min，南京六合县泉水教学实验器材厂)。
1.3主要试剂
Ⅱ型胶原酶购自Wathington公司，蛋白酶E、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司，兔抗Nav1.5抗体由英国曼彻斯特大学生理系提供，膜片钳所用试剂均购自美国Sigma公司，其余的试剂均为国产分析纯。
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1.4溶液配制
(1)正常钙台式液(mmol/L) NaCl 135.0，KCl 5.4。MgCl26H2O 1.0，CaCl2 1.8，NaH22PO40.33，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH值用NaOH调至7.40。
(2)无钙台式液(mmol/L) NaCl135.0，KCl 5.4，MgCl226H2O 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH值用NaOH调至7.35。 (3)Kraft—Brahe(KB)液(mmol/L)KOH 70.0，L-glutamic acid 50.0，KCl 40.0，Taurine20.0，KH2PO4 20.0，MgCl2·6H20 3.0，Glucose10.0，HEPES 10.0，EGTA 0.5，pH值用KOH调至7.40。(4)记录Inu的电极外液(mmol/L) NaCl30.0，Choline-Cl 110.0，KCI 5.4，MgCl2 1.0，HEPES 10.0，NaH2PO4 0.33，Glucose 11.0，CaCl21.0，CdCl2，0.3，pH值用NaOH调至7.30。(5)记录Inu的电极内液(mmol/L) CsCl 120.0，MgCl25.0，CaCl2 1.0，Na2ATP 5.0，HEPES 10.0，EGTA11.0，Glucose 11.0，pH值用CsOH调至7.20。
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1.5豚鼠心室肌细胞急性分离
取豚鼠，先腹腔注射大剂量肝素钠(25 000-35 000 Iu/kg)使其迅速达到肝素化，再用200 g/L乌拉坦(1.5-2.0 g/kg，ip)麻醉。迅速开胸取出心脏置于冰冷的氧饱和的正常钙台式液(4℃)以泵出残血，然后连于Langendorff灌流装置上，以恒流泵维持8 ml/min的灌流速度，经主动脉逆行灌流，灌流液中同时通入95%0，+5%C02的混合气，循环水浴使灌流液温度在36.5-37.0 ℃。用无钙台式液灌流4-7 min，然后用含胶原酶Ⅱ0.2mg/ml、BSA 0.2 mg/ml、蛋白酶E 0.02 mg/ml的无钙液灌流6-15 min，至心脏变软、松弛为止；用无钙液终止消化5-10 min。将心脏从灌流装置上取下，剪去心房，并将心室剪成1 mm3小块，置于含牛血清白蛋白1 mg/ml的KB液中37 ℃温育约5-10 min。从温育液中取上清，以500 r/min离心2min后弃上清，用上述含牛血清白蛋白的KB液将细胞悬浮后4℃保存备用。
1.6全细胞膜片钳记录
[ 下 页 ], 百拇医药(史钰芳)
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[关键词]抗Nav1.5抗体；心室肌细胞；钠电流；全细胞膜片钳技术
电压门控钠通道(Nav)是一种跨膜蛋白，是可兴奋性细胞产生动作电位所必需的，它由a和13亚基构成。其中，编码钠通道a亚基的十种基因已得到鉴定：Nav1.1至Nav1.9及Nax。Nav1.5主要分布于心肌细胞中，由基因scN5A编码，是TTx不敏感性钠通道，能被微摩尔级浓度的TTx阻断；它在心脏动作电位的产生及心脏电冲动的传导中起着主要作用。
Nav1.5对心脏功能的重要性已在对由SCN5A基因突变相关病理表型的众多报告中得到阐述，这说明即使Nav1.5细胞生物学和功能发生微小变化也可能成为人类疾病的发生基础。利用E3靶向作用研制出了亚型特异性抗体——抗Nav1.5抗体，但该抗体对心脏钠通道的功能性作用还不清楚。为此，本实验旨在应用全细胞膜片钳技术，在离子通道水平上考察该抗体对豚鼠心室肌细胞Nav1.5钠通道的影响，为该通道基因相关疾病的分子机制及其治疗的进一步研究打下一定的基础。
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1 材料与方法
1.1 实验动物
豚鼠，雌性，180-250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 实验仪器
膜片钳放大器(Axopateh 200-B，USA)，三维微操纵器(Budeigh，PCS-5000，USA)，倒置显微镜(Axiovertl00，Germany)，玻璃电极拉制仪(Narishige，PC-10，Japan)，玻璃毛坯(内径0.8mm，外径1.8 min，南京六合县泉水教学实验器材厂)。
1.3主要试剂
Ⅱ型胶原酶购自Wathington公司，蛋白酶E、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司，兔抗Nav1.5抗体由英国曼彻斯特大学生理系提供，膜片钳所用试剂均购自美国Sigma公司，其余的试剂均为国产分析纯。
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1.4溶液配制
(1)正常钙台式液(mmol/L) NaCl 135.0，KCl 5.4。MgCl26H2O 1.0，CaCl2 1.8，NaH22PO40.33，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH值用NaOH调至7.40。
(2)无钙台式液(mmol/L) NaCl135.0，KCl 5.4，MgCl226H2O 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH值用NaOH调至7.35。 (3)Kraft—Brahe(KB)液(mmol/L)KOH 70.0，L-glutamic acid 50.0，KCl 40.0，Taurine20.0，KH2PO4 20.0，MgCl2·6H20 3.0，Glucose10.0，HEPES 10.0，EGTA 0.5，pH值用KOH调至7.40。(4)记录Inu的电极外液(mmol/L) NaCl30.0，Choline-Cl 110.0，KCI 5.4，MgCl2 1.0，HEPES 10.0，NaH2PO4 0.33，Glucose 11.0，CaCl21.0，CdCl2，0.3，pH值用NaOH调至7.30。(5)记录Inu的电极内液(mmol/L) CsCl 120.0，MgCl25.0，CaCl2 1.0，Na2ATP 5.0，HEPES 10.0，EGTA11.0，Glucose 11.0，pH值用CsOH调至7.20。
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1.5豚鼠心室肌细胞急性分离
取豚鼠，先腹腔注射大剂量肝素钠(25 000-35 000 Iu/kg)使其迅速达到肝素化，再用200 g/L乌拉坦(1.5-2.0 g/kg，ip)麻醉。迅速开胸取出心脏置于冰冷的氧饱和的正常钙台式液(4℃)以泵出残血，然后连于Langendorff灌流装置上，以恒流泵维持8 ml/min的灌流速度，经主动脉逆行灌流，灌流液中同时通入95%0，+5%C02的混合气，循环水浴使灌流液温度在36.5-37.0 ℃。用无钙台式液灌流4-7 min，然后用含胶原酶Ⅱ0.2mg/ml、BSA 0.2 mg/ml、蛋白酶E 0.02 mg/ml的无钙液灌流6-15 min，至心脏变软、松弛为止；用无钙液终止消化5-10 min。将心脏从灌流装置上取下，剪去心房，并将心室剪成1 mm3小块，置于含牛血清白蛋白1 mg/ml的KB液中37 ℃温育约5-10 min。从温育液中取上清，以500 r/min离心2min后弃上清，用上述含牛血清白蛋白的KB液将细胞悬浮后4℃保存备用。
1.6全细胞膜片钳记录
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