基于ｖｖｈＡ基因ＴａｑＭａｎ实时荧光定量ＰＣＲ快速检测创伤弧菌的研究(2)
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模板，按上法进行TaqMan实时荧光定量PCR检测，以了解其敏感性。以大肠杆菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、志贺痢疾杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌DNA为模板，按上法进行TaqMan实时荧光定量PCR，以了解其特异性。以Ct值差异为观察指标，浓度为1×105-1×107的pMDl9-T-vvhA100标本为模板，用TaqMan实时荧光定量PCR重复检测三次，以了解其重复性。
1.7小鼠感染模型制备及检查
用麦氏比浊法将创伤弧菌新鲜培养物配制成5*105、5*106、5*107 CFU/ml三个浓度的菌液。将体重17-20 g清洁级ICR小鼠分为四组：腹腔感染组、皮下感染组、灌胃感染组、不感染对照组，每组6只，雌雄各半。各感染组按不同途径分别用0.5 ml菌液感染，不同浓度菌液各感染雌雄各一两只小鼠，对照组用0.5 ml无菌培养液代替菌液分别进行腹腔和皮下注射及灌胃。取腹腔及皮下感染4-5 h后濒死小鼠血液、感染处皮下组织，灌胃感染小鼠取血液及肠内容物，血液和皮下组织标本接种于含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂平板上，37℃培养24 h后挑取培养物革兰染色镜检。
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1.8感染标本中创伤弧菌vvhA基因的检测
采用通用型全基因组提取试剂盒(TaKaRa)，分别提取感染和正常对照小鼠50μl血液、约3mm3皮下组织和肠内容物标本中的DNA，取5 μlDNA提取物为模板，采用上述TaqMan实时荧光定量PCR进行检测。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
从创伤弧菌DNA模板中扩增出预期大小vvhA基因片段(图1)。与相关文献报道比较，所克隆的vvhA基因100 bp扩增片段核苷酸序列相似性为100%。创务弧菌WZ01株vvhA基因扩增片段核苷酸序列
2.2 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化
引物和探针之间浓度比例不合适而导致的非特异性竞争是影响TaqMan荧光定量PCR扩增效率和敏感性的主要因素，能检测到产物的最低扩增循环数(ct值)越低、荧光强度增加值(Rn)越高，表明引物和探针之问浓度比例更为合适。在等浓度DNA模板和TaqMan荧光定量PCR反应体积为20μl时，采用不同浓度引物和探针浓度比所获得的ct值和ARn值见表2，当各引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.3 gmol/L时，获得ct值最低和ARn值最高。表2不同引物与探针浓度比的ct值和ARn值测定结果
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2.3 TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性
本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或重组质粒pMDl9-T-vvhA100呈阳性检测结果，其它受检的细菌DNA标本检测结果均为阴性。该TaqMan实时荧光定量PCR可检测出0.0lng创伤弧菌DNA或1*103拷贝数pMDl9-T-vvhA100，常规PCR仅可检出1 ng创伤弧菌DNA或1*103及以上拷贝数pMDl9-T-vvhA100。TaqMan实时定量荧光PCR对不同浓度pMDl9-T-vvhA100标本重复三次检测结果均阳性，且其ct值非常接近(表3)。表3不同浓度pMD19-T-vvhA100重复检测的ct值变化
2.4感染小鼠标本中创伤弧菌及其whA基因检测结果
经腹腔或皮下注射不同菌量小鼠在感染12 h内均死亡，灌胃感染组小鼠在感染12 h内均存活。感染小鼠的血液、皮下组织标本经培养之后均有细菌生长，染色后镜检均为革兰阴性弧菌。腹腔感染组和皮下感染组小鼠的血液和皮下组织标本，TaqMan实时荧光定量PCR检测结果均为阳性，灌胃感染组和正常对照组小鼠标本TaqMan实时荧光定量PCR检测结果均为阴性。
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3 讨论
创伤弧菌分类上属于弧菌属第5群，可分为三个生物型，其中I型和Ⅲ型对人机会致病，Ⅱ型仅对鳗鱼致病，Ⅲ型对人有强致病性，形态学和生化反应检测等均不易区别各生物型及创伤弧菌与其他弧菌。不同地区及病种患者标本中分离的创伤弧菌染色体上均携带vvhA基因，其核苷酸序列也与Ⅱ型创伤弧菌有明显区别，故vvhA基因是用于临床实验室检测人类创伤弧菌感染的靶标。
TaqMan实时荧光定量PCR具有PCR和DNA杂交双重特异性及光谱检测的精确性，使检测特异性有了明显提高。本研究中建立的TaqMan实时荧光定量PCR中所使用的引物和探针序列，经Blast对NCBI中有关序列进行比较后，仅与创伤弧菌vvhA基因序列具有良好的同源性。实际检测结果也显示，笔者建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA有阳性检测结果，对大肠杆菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、志贺痢疾杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌DNA检测结果均为阴性，表明该方法有较高的检测特异性。
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为提高反应的扩增效率及灵敏度，即获得最小ct值和最高ARn值，笔者采用矩阵法对TaqMan实时荧光定量PCR体系中所采用的引物和探针浓度比例进行了优化，优化后的ct值减少了5.51、ARn荧光强度由0.6增长至1.1左右。实验采用所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR，可有效地检出可检测出0.01 ng创伤弧菌DNA或1*103拷贝数pMD19-T-vvhA100，常规PCR仅可检出1 ng创伤弧菌DNA或1*105及以上拷贝数pMDl9-T-vvhA100，表明该方法有很高的检测敏感性。
由于创伤弧菌感染患者的临床标本不易获得，笔者建立了创伤弧菌小鼠感染模型，用vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR检测了不同感染途径小鼠的血液、肠内容物、皮下感染组织标本。结果显示，腹腔感染组和皮下感染组小鼠血液和皮下组织标本创伤弧菌vvhA基因均为阳性，灌胃感染组血液和肠内容物均为阴性。虽然有文献报道，创伤弧菌也可经消化道感染引起食物中毒，但笔得的实验结果表明，正常小鼠消化道感染的创伤弧菌不进入血流，肠内容物未能检出创伤弧菌vvhA基因有可能是肠道细菌DNA干扰所致，应进一步研究加以解决。
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为了获得创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR检测的阳性对照，笔者构建了含vvhA基因100 bp目的扩增片段的重组质粒，测序结果表明所克隆的vvhA基因100 bp片段核苷酸序列与报道的相关序列相似性为100%，作为阳性对照实际使用时也取得良好效果。此外，为了尽可能减少检测所需时间及检测方法的标准化，笔者使用商品化试剂盒提取DNA标本，并通过实验确定采用二步法循环扩增，因而所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR从标本DNA提取至完成检测仅需3 h。
笔者建立的TaqMan实时荧光定量PCR虽不能用于检测粪便标本中的创伤弧菌，但可敏感、特异、快速、准确地检测血液及感染组织中的创伤弧菌，由于原发性败血症和创口感染是创伤弧菌感染危害最大的主要病种，故该方法可用于临床实验室诊断创伤弧菌感染性败血症和创口感染，以指导临床及时采取正确的应对措施减少患者截肢和死亡率。
[ 上 页 ], 百拇医药(吴增辉)