睡眠剥夺大鼠癫痫诱发后ＣＢｌ受体与脑细胞凋亡的关系(1)
江佩芳 夏哲智 江克文 杨翠薇 朱 涛 高 峰 水泉祥
[摘要] 目的 探讨睡眠剥夺大鼠癫痫诱发后海马大麻素CBl受体表达与脑细胞凋亡的关系。方法48只Sprague-Dawley(sD)大鼠，随机分为癫痫诱发前和癫痫诱发后两组，每组24只。每组大鼠又随机分为空白对照组(CC)，睡眠剥夺1 d、3 d、5d组(SD 1 d、SD 3d、SD 5d)。用改良多平台睡眠剥夺法建立快速动眼期(REM)睡眠剥夺模型，戊四氮诱发癫痫。应用RT-PCR方法检测癫痫诱发前后大麻素CBl受体mRNA表达，并观察海马超微结构改变。结果sD 1d组神经元轻度固缩，染色质轻度边距，sD 3d组和sD 5d组均出现神经元凋亡。癫痫诱发后发现CC组大鼠无抽搐，CBl受体mRNA表达较癫痫诱发前明显升高(P<0.01)。sD 1d、sD 3d、sD 5d组大鼠抽搐严重，CBI受体mRNA表达较癫痫诱发前相比差异无显著性(P>0.05)。结论睡眠剥夺能造成神经元凋亡，影响大麻素CBl受体表达。CBl受体表达增高对脑损伤有一定保护作用，能抑制癫痫发作。
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[关键词]大麻素CBl受体；神经元凋亡；癫痫；睡眠剥夺；海马研究发现大脑皮层释放大麻素能够起到自我镇静的作用，内源性大麻素与CBl受体结合，可抑制癫痫发作。睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是睡眠障碍中常见症状，长期睡眠剥夺使人体紧张、易疲劳，癫痫易发。本研究通过建立REM睡眠剥夺模型，分别检测癫痫诱发前后大麻素CBl受体mRNA表达，进一步探讨CBl受体与脑细胞凋亡之间的关系及其在抑制癫痫发作、机体自身稳定调节中所起的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物和分组成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重220～250g，由浙江省医学科学院实验动物研究中心提供。随机分为癫痫诱发前和癫痫诱发后两组，每组24只。每组大鼠又随机分为空白对照组(CC)和睡眠剥夺1d、3d、5d组(SD 1d、SD 3d、SD 5d)。
, 百拇医药
1.1.2睡眠剥夺模型的建立按方法制作110cm×60cm×40cm的鼠箱，采用改良多平台睡眠剥夺法建立REM睡眠剥夺模型，当大鼠进入快速动眼期(REM)时，由于全身肌肉张力降低，节律性地垂头触水而醒来。实验室温度控制在22.0～24.0 ℃8:30～20:30用40瓦日光灯照射0。实验前将各组大鼠放在同一笼中饲养2周，实验前1周将大鼠放在平台上适应，每天适应1h。睡眠剥夺从08:00开始，睡眠剥夺期间灯光持续照射，鼠箱中的水每天更换。CC组为放在一起饲养2周未进行任何处理的大鼠，饲养条件与sD组相同。
1.1.3戊四氮诱发癫痫致痫组动物给予戊四氮(50 mg/kg)(美国Sigma公司)腹腔内注射，观察1小时，记录惊厥等级及发作的潜伏期、持续时间和发作类型。参照Racine标准：(1)0级 无惊厥；(2)工级面部阵挛；(3)Ⅱ级 工级+节律性点头；(4)Ⅲ级 Ⅱ级+前肢阵挛；(5)Ⅳ级Ⅲ级+后肢站立；(6)V级Ⅳ级+跌倒。凡连续记录到3次同等级惊厥发作则确定为该等级发作。
, 百拇医药
1.1.4取材相应时点各组动物用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉，快速断头取脑，在冰上分离双侧海马。用10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，苏木素一伊红(HE)染色用于光镜观察，按电镜要求取1.5mm×1.5mm标本予戊二醛固定，送检浙江大学电镜中心。其余海马置人冻存管中-70℃冻存待用。
1.2方法
1.2.1 RNA抽提 100mg组织加1ml Trizol(上海生工)制成匀浆，加入0.15ml氯仿和0.15ml饱和酚，振荡后离心(4℃，12000 r/rain，15 min)。吸取上清水相至新的离心管中，加0.5 ml异丙醇混匀，室温下孵育10min，离心(4℃，12000 r/min，15min)。弃上清，沉淀物用75%乙醇1ml漩涡清洗，离心(4℃，7500r/rain，5 min)。弃上清，空气自然干燥后，加DEPC水20μl，60℃水浴10min充分溶解RNA，-70℃冻存。
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1.2.2 CDNA合成 逆转录反应体系为20μl，包括RNA 5μl，OligoDNA(0.5μg/μl)3μl，NTP(10mmol/L)2μl，RNAsinlμl，M-MuLV逆转录酶1μl，5×RT缓冲液4μl。70℃ 灭活酶5 min，37℃孵育60 min，70℃延伸10 min。最后将逆转录产物置于-20℃冻存用于PCR扩增。试剂盒由上海生工提供。
1.2.3 PCR扩增 CBl受体的引物序列为5’-CATCATCATCCACACGTCAG-3’.5’-ATGCTGTFGTCTAGAGGCTG-3’，长度为330 bp；内参为GAPDH，引物序列为5’ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3，.5’-CTcAGllC GCCCAGGATGC-3’，长度为528 bP。于PCR仪(美国PTC～200型)内扩增。扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环，反应终末72℃延伸10min。PCR产物在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳(150V，30min)。基因分析凝胶成像系统拍照、分析，用NIH Scion Image(4.0)软件半定量分析，用积分光度(integrate density，ID)表示。取同内参ID的比值作为统计值。
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1.3统计学方法
正态分布资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，偏态分布资料用中位数和四分位数间距表示，组间比较用秩和检验。应用SPSS 10.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 癫痫诱发前大鼠行为及海马超微结构改变
2.1.1行为改变 sD 1d大鼠轻度激惹，sD 3d极度激惹，全身毛竖起，刺激后出现乱咬等攻击性行为，SD 5d转为抑制状态，低头思睡，刺激后出现激惹。空白对照组大鼠行为无明显变化。
2.2.2病理形态学改变光镜显示SD ld海马神经元形态基本正常，核轻度固缩；SD 3d和sD 5d海马神经元核明显固缩，胞浆嗜伊红染色增强。电镜显示SD 1d神经元轻度固缩，染色质轻度边距，
2.2癫痫诱发后大鼠惊厥程度及海马大麻素CBl受体mRNA表达的变化
戊四氮腹腔注射后发现CC组全身毛竖起，节律性点头，无四肢抽搐。sD 1d，SD 3d，sD 5d组抽搐程度严重，潜伏期短(0～7min)，持续时间长达30rain，Racine等级为Ⅲ～V级。
线粒体嵴部分消失，成空泡，粗面内质网数量减
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[摘要] 目的 探讨睡眠剥夺大鼠癫痫诱发后海马大麻素CBl受体表达与脑细胞凋亡的关系。方法48只Sprague-Dawley(sD)大鼠，随机分为癫痫诱发前和癫痫诱发后两组，每组24只。每组大鼠又随机分为空白对照组(CC)，睡眠剥夺1 d、3 d、5d组(SD 1 d、SD 3d、SD 5d)。用改良多平台睡眠剥夺法建立快速动眼期(REM)睡眠剥夺模型，戊四氮诱发癫痫。应用RT-PCR方法检测癫痫诱发前后大麻素CBl受体mRNA表达，并观察海马超微结构改变。结果sD 1d组神经元轻度固缩，染色质轻度边距，sD 3d组和sD 5d组均出现神经元凋亡。癫痫诱发后发现CC组大鼠无抽搐，CBl受体mRNA表达较癫痫诱发前明显升高(P<0.01)。sD 1d、sD 3d、sD 5d组大鼠抽搐严重，CBI受体mRNA表达较癫痫诱发前相比差异无显著性(P>0.05)。结论睡眠剥夺能造成神经元凋亡，影响大麻素CBl受体表达。CBl受体表达增高对脑损伤有一定保护作用，能抑制癫痫发作。
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[关键词]大麻素CBl受体；神经元凋亡；癫痫；睡眠剥夺；海马研究发现大脑皮层释放大麻素能够起到自我镇静的作用，内源性大麻素与CBl受体结合，可抑制癫痫发作。睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是睡眠障碍中常见症状，长期睡眠剥夺使人体紧张、易疲劳，癫痫易发。本研究通过建立REM睡眠剥夺模型，分别检测癫痫诱发前后大麻素CBl受体mRNA表达，进一步探讨CBl受体与脑细胞凋亡之间的关系及其在抑制癫痫发作、机体自身稳定调节中所起的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物和分组成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重220～250g，由浙江省医学科学院实验动物研究中心提供。随机分为癫痫诱发前和癫痫诱发后两组，每组24只。每组大鼠又随机分为空白对照组(CC)和睡眠剥夺1d、3d、5d组(SD 1d、SD 3d、SD 5d)。
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1.1.2睡眠剥夺模型的建立按方法制作110cm×60cm×40cm的鼠箱，采用改良多平台睡眠剥夺法建立REM睡眠剥夺模型，当大鼠进入快速动眼期(REM)时，由于全身肌肉张力降低，节律性地垂头触水而醒来。实验室温度控制在22.0～24.0 ℃8:30～20:30用40瓦日光灯照射0。实验前将各组大鼠放在同一笼中饲养2周，实验前1周将大鼠放在平台上适应，每天适应1h。睡眠剥夺从08:00开始，睡眠剥夺期间灯光持续照射，鼠箱中的水每天更换。CC组为放在一起饲养2周未进行任何处理的大鼠，饲养条件与sD组相同。
1.1.3戊四氮诱发癫痫致痫组动物给予戊四氮(50 mg/kg)(美国Sigma公司)腹腔内注射，观察1小时，记录惊厥等级及发作的潜伏期、持续时间和发作类型。参照Racine标准：(1)0级 无惊厥；(2)工级面部阵挛；(3)Ⅱ级 工级+节律性点头；(4)Ⅲ级 Ⅱ级+前肢阵挛；(5)Ⅳ级Ⅲ级+后肢站立；(6)V级Ⅳ级+跌倒。凡连续记录到3次同等级惊厥发作则确定为该等级发作。
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1.1.4取材相应时点各组动物用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉，快速断头取脑，在冰上分离双侧海马。用10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，苏木素一伊红(HE)染色用于光镜观察，按电镜要求取1.5mm×1.5mm标本予戊二醛固定，送检浙江大学电镜中心。其余海马置人冻存管中-70℃冻存待用。
1.2方法
1.2.1 RNA抽提 100mg组织加1ml Trizol(上海生工)制成匀浆，加入0.15ml氯仿和0.15ml饱和酚，振荡后离心(4℃，12000 r/rain，15 min)。吸取上清水相至新的离心管中，加0.5 ml异丙醇混匀，室温下孵育10min，离心(4℃，12000 r/min，15min)。弃上清，沉淀物用75%乙醇1ml漩涡清洗，离心(4℃，7500r/rain，5 min)。弃上清，空气自然干燥后，加DEPC水20μl，60℃水浴10min充分溶解RNA，-70℃冻存。
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1.2.2 CDNA合成 逆转录反应体系为20μl，包括RNA 5μl，OligoDNA(0.5μg/μl)3μl，NTP(10mmol/L)2μl，RNAsinlμl，M-MuLV逆转录酶1μl，5×RT缓冲液4μl。70℃ 灭活酶5 min，37℃孵育60 min，70℃延伸10 min。最后将逆转录产物置于-20℃冻存用于PCR扩增。试剂盒由上海生工提供。
1.2.3 PCR扩增 CBl受体的引物序列为5’-CATCATCATCCACACGTCAG-3’.5’-ATGCTGTFGTCTAGAGGCTG-3’，长度为330 bp；内参为GAPDH，引物序列为5’ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3，.5’-CTcAGllC GCCCAGGATGC-3’，长度为528 bP。于PCR仪(美国PTC～200型)内扩增。扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环，反应终末72℃延伸10min。PCR产物在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳(150V，30min)。基因分析凝胶成像系统拍照、分析，用NIH Scion Image(4.0)软件半定量分析，用积分光度(integrate density，ID)表示。取同内参ID的比值作为统计值。
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1.3统计学方法
正态分布资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，偏态分布资料用中位数和四分位数间距表示，组间比较用秩和检验。应用SPSS 10.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 癫痫诱发前大鼠行为及海马超微结构改变
2.1.1行为改变 sD 1d大鼠轻度激惹，sD 3d极度激惹，全身毛竖起，刺激后出现乱咬等攻击性行为，SD 5d转为抑制状态，低头思睡，刺激后出现激惹。空白对照组大鼠行为无明显变化。
2.2.2病理形态学改变光镜显示SD ld海马神经元形态基本正常，核轻度固缩；SD 3d和sD 5d海马神经元核明显固缩，胞浆嗜伊红染色增强。电镜显示SD 1d神经元轻度固缩，染色质轻度边距，
2.2癫痫诱发后大鼠惊厥程度及海马大麻素CBl受体mRNA表达的变化
戊四氮腹腔注射后发现CC组全身毛竖起，节律性点头，无四肢抽搐。sD 1d，SD 3d，sD 5d组抽搐程度严重，潜伏期短(0～7min)，持续时间长达30rain，Racine等级为Ⅲ～V级。
线粒体嵴部分消失，成空泡，粗面内质网数量减
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