核因子-kB在烧伤血清复合缺氧致心肌细胞损伤中的作用(1)
[摘要]目的 探讨NF-kB在烧伤血清复合缺氧致心肌细胞损伤中的作用。方法体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，按施加刺激因素及是否进行拮抗剂预处理分为四组：正常对照组(n=4)；烧伤缺氧组(n=4)，10%自制大鼠烧伤血清+缺氧(1%氧浓度)刺激6 h；PDTC组(n=4)，于培养基中加入NF-kB特异抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC，50 mmol/L)；PDTC预处理组(n=4)，PDTC预处理30 min后，施加烧伤缺氧刺激；MTF法检测心肌细胞活力；提取核蛋白，蛋白免疫印迹化学发光法检测NF-kB核内含量；EMSA检测NF-kB DNA结合活性。结果 烧伤缺氧组NF-kB核内水平较正常组显著升高，DNA结合活性提高，心肌细胞活力下降；PDTC预处理后，核内NF-kB水平较烧伤缺氧组明显降低，DNA结合活性显著降低，烧伤缺氧所致的心肌细胞损伤明显减轻，活力提高。结论NF-kB参与烧伤缺氧致心肌细胞损伤作用，阻断NF-kB可能对防治严重烧伤所致的心肌细胞损伤具有一定潜在价值。
[关键词]缺氧；烧伤；核因子-kB
, 百拇医药
核因子-kB广泛参与多种细胞的生理、病理过程，许多研究提示NF-kB参与多种心血管事件；防治严重烧伤后心肌细胞损伤，维护心功能一直是烧伤防治的一个重点。研究通过对SD大鼠乳鼠心肌细胞施加烧伤血清+缺氧刺激模拟心肌细胞在严重烧伤早期所处的内环境，以此探讨NF-kB在严重烧伤早期心肌细胞损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1试剂和仪器
DMEM/F12培养基(Hycl one公司，美国)，NF-kB-p65，NF-kB-p50抗体(北京中山生物公司)，山羊抗兔IgG-HRP(Cell Signaling technology公司，美国)，NF-kB特异抑制剂PDTC(sigma公司，美国)，BCA-200蛋白定量试剂盒、LightShift(r)Chemiluminescent EMSA kit(Plerce公司，美国)；半干转移电泳仪(Pharmacia公司，瑞典)；分光光度计(Beckman公司，美国)；紫外透射仪(Olympus公司，日本)。
, 百拇医药
1.2正常大鼠及烧伤大鼠血清制备
正常及40%、Ⅲ度烧伤6 h后SD大鼠，无菌操作抽取腹主动脉血。4℃过夜待血块凝缩，仔细吸出血清，4℃离心(3000 r/min)15 min，取上清，56℃加热30 min灭活补体。分装，-20℃冻存备用。
1.3乳鼠原代心肌细胞培养及处理
心肌细胞来源于正常SD大鼠之乳鼠心室肌，心肌细胞分离采用胰酶组织消化法，纯化采用差速贴壁法和Brdu化学抑制法。将消化后细胞接种至六孔板，置入细胞培养箱，隔日换液，改用不含Brdu的培养基。4～5 d后施加烧伤血清+缺氧刺激(以下简称烧伤缺氧)，即于正常培养的心肌细胞中加入体积分数10%的烧伤血清并进行缺氧培养(37℃，O2、N、CO2的体积分数分别为1%、94%、5%)6 h。
1.4心肌细胞核内NF-kB检测
, 百拇医药
收集细胞，PBS冲洗2次后，按照Dignam等人方法准备核抽提物2，BCA法蛋白定量。20μg总蛋白10%SDS-PAGE电泳分离，电转于硝酸纤维素膜，之后20g/L脱脂奶粉-FBS溶液室温封闭1 h，加入特异性NF-kB-p50/p65-抗4℃保温过夜，0.05%TBST洗膜，每次5 min，共3次，山羊抗兔IgG-HRP 37℃孵育1 h，同法洗膜3次，化学发光底物孵育，硝酸纤维素膜暗室感光胶片感光，冲洗。扫描后Bandscsn 5.0行灰度分析，以灰度值表示。
1.5 MTT法检测细胞活力
细胞接种于96孔板，培养4～5 d，烧伤缺氧刺激6 h，按培养基的1/10比例加入MTT(5 mg/ml)，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸弃上清。加入定量二甲亚砜，振荡10 min，使结晶充分溶解。490 mm波长分光光度计测定两组OD490值(空白对照为不加细胞只加培养液，空白孔调零)。
, http://www.100md.com
1.6凝胶迁移滞留分析
核蛋白的提取参照文献进行；根据文献设计NF-kB特异结合探针，由上海博亚生物技术有限公司合成，并用生物素进行5’端标记。 S：5’-ACT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’ A：3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’
按LightShift(r)Chemiluminescent EMSA kit方法操作。Biotin标记双链溶于TE溶液中，20μg核蛋白与2 μl标记DNA探针于结合缓冲液中混合，室温孵育20min，加入5μl加样缓冲液，5%聚丙烯酰胺电泳分离，0.5×TBE缓冲液中电转样本至尼龙膜，紫外交联。将尼龙膜放在封闭液，抗生物素抗体孵育20 min，洗涤液冲洗4次，每次5 min，平衡5 min，化学发光底物孵育5 min，曝光、显影，扫描后Bandscan5.0行灰度分析，以灰度值表示。
, 百拇医药 1.7统计学方法
采用SPSS 11.0统计学软件进行结果处理：实验所得数据采用均数±标准(x±s)表示，均数比较采用单因素方差分析，以P
2.2心肌细胞核内NF-kB-p65和NF-kB-p50水平 提取核蛋白，蛋白免疫印迹化学发光法检测移位于核内的NF-kB可反映NF-kB的活化情况。心肌细胞核内NF-kB表达水平，NF-kB表达在烧伤缺氧刺激后较正常对照组明显提高，灰度分析显示有统计学意义(P
2.3心肌细胞内NF-kB DNA结合活性 为进一步探讨烧伤缺氧对NF-kB的DNA结合活性的影响，采用与转录因子NF-kB特异结合的碱基序列探针进行EMSA实验。结果显示，正常对照组、PDTC组、烧伤缺氧组、PDTC预处理组都可见NF-kB与DNA的结合带。采用200倍浓度的非标记生物素NF-kB探针进行超竞争，结合带消失。反应体系中加人p65和p50抗体则结合带中有部分上移或减少。因此，可肯定此结合带为NF-kB特异性, 百拇医药(范鹏举 李 珍 黄晓元 郑 军 黄跃生 雷少荣)
[关键词]缺氧；烧伤；核因子-kB
, 百拇医药
核因子-kB广泛参与多种细胞的生理、病理过程，许多研究提示NF-kB参与多种心血管事件；防治严重烧伤后心肌细胞损伤，维护心功能一直是烧伤防治的一个重点。研究通过对SD大鼠乳鼠心肌细胞施加烧伤血清+缺氧刺激模拟心肌细胞在严重烧伤早期所处的内环境，以此探讨NF-kB在严重烧伤早期心肌细胞损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1试剂和仪器
DMEM/F12培养基(Hycl one公司，美国)，NF-kB-p65，NF-kB-p50抗体(北京中山生物公司)，山羊抗兔IgG-HRP(Cell Signaling technology公司，美国)，NF-kB特异抑制剂PDTC(sigma公司，美国)，BCA-200蛋白定量试剂盒、LightShift(r)Chemiluminescent EMSA kit(Plerce公司，美国)；半干转移电泳仪(Pharmacia公司，瑞典)；分光光度计(Beckman公司，美国)；紫外透射仪(Olympus公司，日本)。
, 百拇医药
1.2正常大鼠及烧伤大鼠血清制备
正常及40%、Ⅲ度烧伤6 h后SD大鼠，无菌操作抽取腹主动脉血。4℃过夜待血块凝缩，仔细吸出血清，4℃离心(3000 r/min)15 min，取上清，56℃加热30 min灭活补体。分装，-20℃冻存备用。
1.3乳鼠原代心肌细胞培养及处理
心肌细胞来源于正常SD大鼠之乳鼠心室肌，心肌细胞分离采用胰酶组织消化法，纯化采用差速贴壁法和Brdu化学抑制法。将消化后细胞接种至六孔板，置入细胞培养箱，隔日换液，改用不含Brdu的培养基。4～5 d后施加烧伤血清+缺氧刺激(以下简称烧伤缺氧)，即于正常培养的心肌细胞中加入体积分数10%的烧伤血清并进行缺氧培养(37℃，O2、N、CO2的体积分数分别为1%、94%、5%)6 h。
1.4心肌细胞核内NF-kB检测
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收集细胞，PBS冲洗2次后，按照Dignam等人方法准备核抽提物2，BCA法蛋白定量。20μg总蛋白10%SDS-PAGE电泳分离，电转于硝酸纤维素膜，之后20g/L脱脂奶粉-FBS溶液室温封闭1 h，加入特异性NF-kB-p50/p65-抗4℃保温过夜，0.05%TBST洗膜，每次5 min，共3次，山羊抗兔IgG-HRP 37℃孵育1 h，同法洗膜3次，化学发光底物孵育，硝酸纤维素膜暗室感光胶片感光，冲洗。扫描后Bandscsn 5.0行灰度分析，以灰度值表示。
1.5 MTT法检测细胞活力
细胞接种于96孔板，培养4～5 d，烧伤缺氧刺激6 h，按培养基的1/10比例加入MTT(5 mg/ml)，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸弃上清。加入定量二甲亚砜，振荡10 min，使结晶充分溶解。490 mm波长分光光度计测定两组OD490值(空白对照为不加细胞只加培养液，空白孔调零)。
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1.6凝胶迁移滞留分析
核蛋白的提取参照文献进行；根据文献设计NF-kB特异结合探针，由上海博亚生物技术有限公司合成，并用生物素进行5’端标记。 S：5’-ACT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’ A：3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’
按LightShift(r)Chemiluminescent EMSA kit方法操作。Biotin标记双链溶于TE溶液中，20μg核蛋白与2 μl标记DNA探针于结合缓冲液中混合，室温孵育20min，加入5μl加样缓冲液，5%聚丙烯酰胺电泳分离，0.5×TBE缓冲液中电转样本至尼龙膜，紫外交联。将尼龙膜放在封闭液，抗生物素抗体孵育20 min，洗涤液冲洗4次，每次5 min，平衡5 min，化学发光底物孵育5 min，曝光、显影，扫描后Bandscan5.0行灰度分析，以灰度值表示。
, 百拇医药 1.7统计学方法
采用SPSS 11.0统计学软件进行结果处理：实验所得数据采用均数±标准(x±s)表示，均数比较采用单因素方差分析，以P
2.2心肌细胞核内NF-kB-p65和NF-kB-p50水平 提取核蛋白，蛋白免疫印迹化学发光法检测移位于核内的NF-kB可反映NF-kB的活化情况。心肌细胞核内NF-kB表达水平，NF-kB表达在烧伤缺氧刺激后较正常对照组明显提高，灰度分析显示有统计学意义(P
2.3心肌细胞内NF-kB DNA结合活性 为进一步探讨烧伤缺氧对NF-kB的DNA结合活性的影响，采用与转录因子NF-kB特异结合的碱基序列探针进行EMSA实验。结果显示，正常对照组、PDTC组、烧伤缺氧组、PDTC预处理组都可见NF-kB与DNA的结合带。采用200倍浓度的非标记生物素NF-kB探针进行超竞争，结合带消失。反应体系中加人p65和p50抗体则结合带中有部分上移或减少。因此，可肯定此结合带为NF-kB特异性, 百拇医药(范鹏举 李 珍 黄晓元 郑 军 黄跃生 雷少荣)