重症急性胰腺炎大鼠HMGB1对肠上皮细胞occludin表达的影响(2)
【Key words】Pancreatitis； Intestinal mucosal barrier； High mobility group box—1 protein； Tight junction
重症急性胰腺炎( severe acute pancreatitis， SAP) 是临床上一种较常见的急重症，常继发感染、腹膜炎、休克等并发症，病情凶险，病死率高[1—4]。SAP时可继发肠道屏障功能障碍。此时，肠黏膜上皮细胞紧密连接相关蛋白的结构和功能异常，可导致肠黏膜上皮细胞通透性增高，从而导致细菌与毒素易位，继发感染和全身炎症反应[5—7]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box—1 protein， HMGB1)作为一种重要的晚期炎症介质，在SAP大鼠肠黏膜屏障功能障碍的发生发展中具有重要意义[8—10]。本研究通过观察SAP大鼠肠组织内HMGB1表达的变化对肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin表达的影响，探讨SAP时HMGB1介导肠黏膜屏障功能障碍的机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
牛磺胆酸钠、戊巴比妥钠、二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)、D—乳酸脱氢酶及标准品均购自美国Sigma公司；内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司；羊抗HMGB1单克隆抗体与兔抗occludin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体与碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体购自深圳晶美公司；免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术公司；RNA提取及PCR扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司；凝胶扫描分析系统，美国Kodak公司；
1.2 动物分组与SAP模型制备
健康雄性Wistar大鼠30只，体质量270～330 g，由中国医科大学实验动物中心提供。随机(随机数字法)分成对照组(n=10)、SAP组(n=10)以及SAP建模后PDTC处理组(n=10)。逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠制备SAP动物模型[9]。大鼠术前12 h禁食，不禁饮。2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(1 ml/kg)，常规消毒后，腹部正中切口入腹腔，找到胆胰管，于其出肝门端以动脉夹暂时夹闭胆管，以5号针头注射器逆行刺入胆胰管内，于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时夹闭胆胰管，以0.1 ml/min 速度匀速注入5%牛磺胆酸钠(1.5 ml/kg)，注射完毕后10 min去除动脉夹，逐层关腹。术后禁食，自由饮水，皮下注射生理盐水40 ml/(kg·6 h)，行液体复苏。对照组麻醉后取距回肠末端10 cm左右小肠组织和胰头部胰腺组织；PDTC组于SAP建模后即刻腹腔注射PDTC(100 mg/kg)，SAP组及PDTC组均于建模后24 h取材，部位同对照组。腹主动脉采血，离心(3000 r/min，15 min)分离血浆，—80 ℃冻存待测。无菌采取组织，液氮速冻，—70 ℃贮存备用。
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1.3 观察指标
1.3.1 测定血浆AMY、LPS及D—乳酸水平 分别测定3组大鼠血浆AMY、LPS及D—乳酸水平的变化；用HITACHI 7170全自动生化分析仪检测血浆AMY；采用动态浊度法测定血浆LPS水平；采用改良酶学分光光度法检测血浆D—乳酸水平。
1.3.2 胰腺与肠黏膜的组织病理变化 将胰腺组织、肠组织标本用10%的中性甲醛固定，制成石蜡切片，苏木素—伊红(HE)染色，行常规病理检查。
1.3.3 免疫组织化学方法检测肠组织中occludin蛋白的表达 肠组织石蜡切片脱蜡、水化，3% H2O2孵育5 min，pH 6.0枸橼酸缓冲液微波修复(95 ℃ 10 min)，加入1∶200稀释的兔抗occludin单克隆抗体，4 ℃过夜。复温后分别加入生物素标记的羊抗兔IgG抗体，37 ℃ 30 min，DAB 显色。同时设不加一抗的阴性对照。
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1.3.4 RT—PCR法测定肠组织HMGB1 mRNA的表达水平 取小肠组织80 mg，用Trizol一步法提取组织总RNA，用半定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术对转录产物进行扩增。以三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogehase， GAPDH)作为内参对照，扩增产物分别经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以目的基因与内参对照的比值为基因表达的相对含量。大鼠HMGB1序列[11](扩增片段为680 bp)：5’—ATGGGCAAAGGAGATCCTA—3’(正义链)；5’—ATTCATCATCATCATCTTCT—3’(反义链)；大鼠GAPDH序列[11](扩增片段为309 bp)：5’—TCCCTCAAGATTGTCAGCAA—3’(正义链)；5’—AGATCCACAACGGATACATT—3’(反义链)。
1.3.5 Western blot法测定肠组织HMGB1和occludin的表达水平 分别取200 mg肠组织，4 ℃匀浆，加入蛋白提取液，12000 r/min 离心20 min，取上清液，以考马斯亮蓝法进行蛋白定量。分别取40 μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，经SDS—PAGE电泳分离样品后电转移至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭，加入1∶400羊抗HMGB1抗体或1∶1000的兔抗occludin抗体，4 ℃孵育过夜后，加入1∶1000辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG或1∶2000碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体，37 ℃孵育1 h，显色。以β—actin作为内参对照。采用凝胶成像分析系统(GDS—8000)测定各条带的吸光度值，occludin蛋白相对含量=occludin蛋白吸光度值/β—actin吸光度值。
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重症急性胰腺炎( severe acute pancreatitis， SAP) 是临床上一种较常见的急重症，常继发感染、腹膜炎、休克等并发症，病情凶险，病死率高[1—4]。SAP时可继发肠道屏障功能障碍。此时，肠黏膜上皮细胞紧密连接相关蛋白的结构和功能异常，可导致肠黏膜上皮细胞通透性增高，从而导致细菌与毒素易位，继发感染和全身炎症反应[5—7]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box—1 protein， HMGB1)作为一种重要的晚期炎症介质，在SAP大鼠肠黏膜屏障功能障碍的发生发展中具有重要意义[8—10]。本研究通过观察SAP大鼠肠组织内HMGB1表达的变化对肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin表达的影响，探讨SAP时HMGB1介导肠黏膜屏障功能障碍的机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
牛磺胆酸钠、戊巴比妥钠、二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)、D—乳酸脱氢酶及标准品均购自美国Sigma公司；内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司；羊抗HMGB1单克隆抗体与兔抗occludin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体与碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体购自深圳晶美公司；免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术公司；RNA提取及PCR扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司；凝胶扫描分析系统，美国Kodak公司；
1.2 动物分组与SAP模型制备
健康雄性Wistar大鼠30只，体质量270～330 g，由中国医科大学实验动物中心提供。随机(随机数字法)分成对照组(n=10)、SAP组(n=10)以及SAP建模后PDTC处理组(n=10)。逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠制备SAP动物模型[9]。大鼠术前12 h禁食，不禁饮。2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(1 ml/kg)，常规消毒后，腹部正中切口入腹腔，找到胆胰管，于其出肝门端以动脉夹暂时夹闭胆管，以5号针头注射器逆行刺入胆胰管内，于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时夹闭胆胰管，以0.1 ml/min 速度匀速注入5%牛磺胆酸钠(1.5 ml/kg)，注射完毕后10 min去除动脉夹，逐层关腹。术后禁食，自由饮水，皮下注射生理盐水40 ml/(kg·6 h)，行液体复苏。对照组麻醉后取距回肠末端10 cm左右小肠组织和胰头部胰腺组织；PDTC组于SAP建模后即刻腹腔注射PDTC(100 mg/kg)，SAP组及PDTC组均于建模后24 h取材，部位同对照组。腹主动脉采血，离心(3000 r/min，15 min)分离血浆，—80 ℃冻存待测。无菌采取组织，液氮速冻，—70 ℃贮存备用。
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1.3.1 测定血浆AMY、LPS及D—乳酸水平 分别测定3组大鼠血浆AMY、LPS及D—乳酸水平的变化；用HITACHI 7170全自动生化分析仪检测血浆AMY；采用动态浊度法测定血浆LPS水平；采用改良酶学分光光度法检测血浆D—乳酸水平。
1.3.2 胰腺与肠黏膜的组织病理变化 将胰腺组织、肠组织标本用10%的中性甲醛固定，制成石蜡切片，苏木素—伊红(HE)染色，行常规病理检查。
1.3.3 免疫组织化学方法检测肠组织中occludin蛋白的表达 肠组织石蜡切片脱蜡、水化，3% H2O2孵育5 min，pH 6.0枸橼酸缓冲液微波修复(95 ℃ 10 min)，加入1∶200稀释的兔抗occludin单克隆抗体，4 ℃过夜。复温后分别加入生物素标记的羊抗兔IgG抗体，37 ℃ 30 min，DAB 显色。同时设不加一抗的阴性对照。
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1.3.4 RT—PCR法测定肠组织HMGB1 mRNA的表达水平 取小肠组织80 mg，用Trizol一步法提取组织总RNA，用半定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术对转录产物进行扩增。以三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogehase， GAPDH)作为内参对照，扩增产物分别经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以目的基因与内参对照的比值为基因表达的相对含量。大鼠HMGB1序列[11](扩增片段为680 bp)：5’—ATGGGCAAAGGAGATCCTA—3’(正义链)；5’—ATTCATCATCATCATCTTCT—3’(反义链)；大鼠GAPDH序列[11](扩增片段为309 bp)：5’—TCCCTCAAGATTGTCAGCAA—3’(正义链)；5’—AGATCCACAACGGATACATT—3’(反义链)。
1.3.5 Western blot法测定肠组织HMGB1和occludin的表达水平 分别取200 mg肠组织，4 ℃匀浆，加入蛋白提取液，12000 r/min 离心20 min，取上清液，以考马斯亮蓝法进行蛋白定量。分别取40 μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，经SDS—PAGE电泳分离样品后电转移至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭，加入1∶400羊抗HMGB1抗体或1∶1000的兔抗occludin抗体，4 ℃孵育过夜后，加入1∶1000辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG或1∶2000碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体，37 ℃孵育1 h，显色。以β—actin作为内参对照。采用凝胶成像分析系统(GDS—8000)测定各条带的吸光度值，occludin蛋白相对含量=occludin蛋白吸光度值/β—actin吸光度值。
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