基质金属蛋白酶9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响(3)
1.2.8 ELISA法检测细胞胶原(羟脯氨酸)分泌能力 将10 000 pg/ml的标准品配制成0～5000 pg/ml系列的标准液用于制备标准曲线。各待测蛋白样品取100 μl加入酶标板，37 ℃覆膜孵育90 min；弃去孔内液体，用洗涤液洗板2次；每孔加入生物素抗体工作液100 μl，37 ℃覆膜孵育60 min；弃去孔内液体，反复洗板3次，每次浸泡1 min；每孔加入ABC工作液100 μl，37 ℃反应30 min；弃去孔内液体，反复洗板5次，每次浸泡1～2 min；每孔加入已在37 ℃平衡30 min的TAB显色液100 μl，37℃避光反应，当标准孔前3～4孔出现明显的梯度蓝色时，每孔加入TMB终止液100 μl，终止反应(显色时间不要超过30 min)，在酶标仪上读取每孔450 nm波长的吸光度。在标准曲线上查出相应的含量。
1.2.9 划痕实验评价细胞横向迁移能力 于超净工作台内用灭菌小枪头沿着直尺在6孔板底划痕，划痕完毕后用PBS沿着划痕反复冲洗，将划痕区域的细胞彻底洗净后加上目的培养基继续培养6 h；倒置显微镜下选择5个不同视野，分别于划痕后0 h和6 h拍照测量划痕两侧细胞之间的距离，取平均值计算细胞迁移速率。细胞迁移速率 =(0 h划痕宽度—6 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
, http://www.100md.com
1.2.10 Transwell法评价细胞纵向迁移能力 对数生长期细胞常规消化后用含0.5%FBS的目的培养基制成细胞悬液，调整密度为1.0×105 /ml，取100 μl细胞悬液加入transwell上室，在下室内加含10 %FBS的目的培养基500 μl，继续培养16 h，取出transwell的上室，PBS洗3次，并用棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞，4 %多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，随机选取4个视野(×200)在倒置显微镜下计数移至微孔膜下面的细胞数，取其平均值。
1.3 统计学方法
计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用成组t检验。用SPSS 12.0统计软件进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP 9高表达大鼠皮肤成纤维细胞模型的建立
, 百拇医药
对照组大鼠皮肤成纤维细胞MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别为(1.00±0.00)、(40.4±5.9)pg/ml和(0.57±0.12)；MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别为(7.05±1.02)、(206.9±33.6)pg/ml和(1.47±0.13)，较对照组分别升高6.05倍、4.12倍和1.58倍(P<0.01)，提示MMP 9高表达大鼠皮肤成纤维细胞模型建立成功。
2.2 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞增殖功
能、活力及胶原分泌能力的影响
与对照组比较，MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞S期的比例减少29.8 %，增殖指数下降18.1 %，细胞活力减低23.3 %，胶原(羟脯氨酸)分泌能力下降68.7 %(P<0.01)，见表1。
2.3 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞横向
, 百拇医药
迁移能力的影响
与对照组(38.7±2.6)%比较，MMP 9高表达组(21.3±2.1)%大鼠皮肤成纤维细胞6 h横向迁移率下降45.0 %(t=11.529，P<0.01)，见图1、图2。
2.4 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞纵向
迁移能力的影响
与对照组(90.6±3.8)比较，MMP 9高表达组(71.2±3.8)大鼠皮肤成纤维细胞纵向迁移细胞数减少21.4 %(t=8.124，P<0.01)，见图3。
3 讨论
成纤维细胞是真皮内主要的修复细胞，占全部细胞数的40 %～60 %，其生物学效应在维持皮肤正常形态和创面修复中起着至关重要的作用[13]。既往有学者发现糖尿病患者皮肤成纤维细胞的DNA合成水平显著下降，凋亡增加，表明在糖尿病病理状态下细胞的增殖受到抑制[14]。另有研究表明，长程糖尿病(8周)大鼠皮肤成纤维细胞处于G0/G1期的细胞显著减少，S期细胞明显增多，但G2/M期的细胞却没有相应增加[15]。这种“增”与“殖”分离的现象提示，在糖尿病环境下皮肤中的成纤维细胞有“自我更新”的要求，因而启动了增殖周期，但却由于某些原因导致细胞不能有效进入G2/M期。然而在短程糖尿病组大鼠却未见明显“增”与“殖”分离的情况。成纤维细胞这种生物学行为的改变是否与糖尿病环境下MMP 9的高水平表达有关，目前国内外未见相关报道。本研究发现，MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞的MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别较对照组升高6.05倍、4.12倍和1.58倍；与此同时S期细胞的比例较对照组减少29.8%，增殖指数下降18.1%；CCK—8检测发现细胞活力降低23.3%。与既往研究结果一致[15]。提示成纤维细胞的增殖受抑和活力下降很可能与MMP 9高水平表达有关。
伤口愈合以成纤维细胞的增殖、迁移、肉芽组织形成、胶原分泌、创口胶原化瘢痕形成及改建为特点，需要依赖许多不同的细胞、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分和可溶性介质的共同参与[16]。成纤维细胞作为合成胶原蛋白最主要的细胞，其增殖障碍和活力下降必然对新生胶原的合成和创面修复具有负面的作用。本研究发现，MMP 9高表达组细胞合成羟脯氨酸的量较对照组下降68.7%。这提示在糖尿病环境下，一方面高MMP 9活性使ECM降解增加；另一方面由于细胞数量减少、活力下降，导致胶原合成不足，使胶原代谢处于负平衡状态，进而延缓糖尿病足伤口的愈合。, 百拇医药(薛声能 雷娟 杨川 林刁珠 严励)
1.2.9 划痕实验评价细胞横向迁移能力 于超净工作台内用灭菌小枪头沿着直尺在6孔板底划痕，划痕完毕后用PBS沿着划痕反复冲洗，将划痕区域的细胞彻底洗净后加上目的培养基继续培养6 h；倒置显微镜下选择5个不同视野，分别于划痕后0 h和6 h拍照测量划痕两侧细胞之间的距离，取平均值计算细胞迁移速率。细胞迁移速率 =(0 h划痕宽度—6 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
, http://www.100md.com
1.2.10 Transwell法评价细胞纵向迁移能力 对数生长期细胞常规消化后用含0.5%FBS的目的培养基制成细胞悬液，调整密度为1.0×105 /ml，取100 μl细胞悬液加入transwell上室，在下室内加含10 %FBS的目的培养基500 μl，继续培养16 h，取出transwell的上室，PBS洗3次，并用棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞，4 %多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，随机选取4个视野(×200)在倒置显微镜下计数移至微孔膜下面的细胞数，取其平均值。
1.3 统计学方法
计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用成组t检验。用SPSS 12.0统计软件进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP 9高表达大鼠皮肤成纤维细胞模型的建立
, 百拇医药
对照组大鼠皮肤成纤维细胞MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别为(1.00±0.00)、(40.4±5.9)pg/ml和(0.57±0.12)；MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别为(7.05±1.02)、(206.9±33.6)pg/ml和(1.47±0.13)，较对照组分别升高6.05倍、4.12倍和1.58倍(P<0.01)，提示MMP 9高表达大鼠皮肤成纤维细胞模型建立成功。
2.2 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞增殖功
能、活力及胶原分泌能力的影响
与对照组比较，MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞S期的比例减少29.8 %，增殖指数下降18.1 %，细胞活力减低23.3 %，胶原(羟脯氨酸)分泌能力下降68.7 %(P<0.01)，见表1。
2.3 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞横向
, 百拇医药
迁移能力的影响
与对照组(38.7±2.6)%比较，MMP 9高表达组(21.3±2.1)%大鼠皮肤成纤维细胞6 h横向迁移率下降45.0 %(t=11.529，P<0.01)，见图1、图2。
2.4 MMP 9高表达对大鼠皮肤成纤维细胞纵向
迁移能力的影响
与对照组(90.6±3.8)比较，MMP 9高表达组(71.2±3.8)大鼠皮肤成纤维细胞纵向迁移细胞数减少21.4 %(t=8.124，P<0.01)，见图3。
3 讨论
成纤维细胞是真皮内主要的修复细胞，占全部细胞数的40 %～60 %，其生物学效应在维持皮肤正常形态和创面修复中起着至关重要的作用[13]。既往有学者发现糖尿病患者皮肤成纤维细胞的DNA合成水平显著下降，凋亡增加，表明在糖尿病病理状态下细胞的增殖受到抑制[14]。另有研究表明，长程糖尿病(8周)大鼠皮肤成纤维细胞处于G0/G1期的细胞显著减少，S期细胞明显增多，但G2/M期的细胞却没有相应增加[15]。这种“增”与“殖”分离的现象提示，在糖尿病环境下皮肤中的成纤维细胞有“自我更新”的要求，因而启动了增殖周期，但却由于某些原因导致细胞不能有效进入G2/M期。然而在短程糖尿病组大鼠却未见明显“增”与“殖”分离的情况。成纤维细胞这种生物学行为的改变是否与糖尿病环境下MMP 9的高水平表达有关，目前国内外未见相关报道。本研究发现，MMP 9高表达组大鼠皮肤成纤维细胞的MMP 9 mRNA、蛋白表达量及活性，分别较对照组升高6.05倍、4.12倍和1.58倍；与此同时S期细胞的比例较对照组减少29.8%，增殖指数下降18.1%；CCK—8检测发现细胞活力降低23.3%。与既往研究结果一致[15]。提示成纤维细胞的增殖受抑和活力下降很可能与MMP 9高水平表达有关。
伤口愈合以成纤维细胞的增殖、迁移、肉芽组织形成、胶原分泌、创口胶原化瘢痕形成及改建为特点，需要依赖许多不同的细胞、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分和可溶性介质的共同参与[16]。成纤维细胞作为合成胶原蛋白最主要的细胞，其增殖障碍和活力下降必然对新生胶原的合成和创面修复具有负面的作用。本研究发现，MMP 9高表达组细胞合成羟脯氨酸的量较对照组下降68.7%。这提示在糖尿病环境下，一方面高MMP 9活性使ECM降解增加；另一方面由于细胞数量减少、活力下降，导致胶原合成不足，使胶原代谢处于负平衡状态，进而延缓糖尿病足伤口的愈合。, 百拇医药(薛声能 雷娟 杨川 林刁珠 严励)