缺血后处理对大鼠缺血—再灌注肺损伤血红素加氧酶—1表达的影响(2)
【Key words】Ischemic postconditioning；Ischemia—reperfusion；Injury；Lung；Heme oxygenase—1；Hemin；ZnPPⅨ；Wet/dry weight ratio
肺缺血—再灌注损伤(IRI)是临床常见的病理生理现象之一，可发生于创伤、休克、心肺转流、肺移植和肺袖状切除等情况，因此，倍受相关学科关注[1—2]。缺血后处理(IPO)是指恢复血流时立刻给予一次或多次短暂重复预灌注/停灌注，能提高缺血器官对之前发生的较长时间缺血的耐受性[3—4]。血红素加氧酶(heme oxygenase， HO)是血红素降解过程中的限速酶，HO在应激条件下对机体具有保护作用，特别是HO—1高表达对器官IRI具有保护作用[5—6]；本科室前期研究已证实HO—1高表达对内毒素引起的急性肺损伤具有保护作用。研究表明，IPO可减轻心肌、肝脏、肾脏的IRI，但有关IPO对肺IRI的保护作用研究较少，HO—1是否参与了肺IPO的保护机制，目前尚不明确。本研究拟观察IPO对IRI肺组织HO—1的表达及肺损伤的影响，探讨IPO对肺IRI保护作用的机制，为临床中可能发生的肺缺血—再灌注损伤的预防和治疗研究提供参考。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验材料
氯化高铁血红素、锌原卟啉Ⅸ(Sigma公司，美国)，HO—1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，MDA测试盒(南京建成生物工程研究所)，DW—2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)，i—STAT临床血气分析仪(香港力新仪器有限公司)，OLYMPUS BX50显微摄影系统(OLYMPUS公司，日本)和HIPAS—2000型计算机图像分析软件(武汉千屏影像技术有限公司)。
1.2 动物分组及模型制备
本实验在武汉大学人民医院麻醉科实验室进行。SPF级SD大鼠48只，雌雄不拘，体质量(210±20 )g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。48只SD大鼠随机(随机数字法)分成6组(n=8)：假手术组(S组)、缺血—再灌注组(I/R组)、缺血后处理组(IPO组)、HO—1诱导剂氯化高铁血红素+缺血—再灌注组(HM+I/R组)、HO—1抑制剂锌原卟啉Ⅸ+缺血后处理组(ZnPPⅨ+IPO组)和HO—1诱导剂+假手术组(HM+S组)。实验前禁食12 h，自由饮水。7%水合氯醛5 ml/kg腹腔内注射麻醉，气管切开插管，连接呼吸机行机械通气。左侧股静脉插管、固定，以微量泵持续输注含有维库溴铵和晶胶比为3∶1的混合液，以微量泵输入芬太尼维持麻醉；右侧股动脉置管，持续监测平均动脉压和采血。经左侧第5肋间开胸，游离左肺门。推注肝素500 U/kg抗凝，于吸气末用无创血管夹闭左肺门，阻断左支气管及肺动、静脉(以肺无舒缩为阻断标准)，形成肺缺血模型。S组不缺血持续灌注150 min；I/R组缺血45 min，再灌注105 min；IPO组缺血45 min后，短暂预灌注30 s，停灌30 s，反复3次，再恢复灌注102 min；HM+I/R组于术前连续2 d腹腔注射氯化高铁血红素40 μmol/(kg·d)，手术操作同I/R组；ZnPPⅨ+IPO组于术前24 h腹腔注射锌原卟啉Ⅸ 20 mg/(kg·d)，后续操作同IPO组；HM+S组术前操作同HM+I/R组，术中同S组。术前无需给药的各组腹腔注射等剂量的生理盐水。
, 百拇医药
1.3 检测指标及方法
分别于机械通气20 min (T1)和实验结束前(T2)从股动脉采血立刻测定动脉血氧分压(PaO2)。实验结束后抽取股动脉血2 ml，4 ℃4000 r/min离心10 min，留取上清液，—70 ℃保存，按试剂盒说明用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量。留取左肺部分组织，80 ℃恒温箱烤24 h至肺干质量恒定，计算肺湿/干质量比(W/D)。取左肺叶0.5 cm ×0.5 cm组织，制作4 mm厚石蜡切片，SABC法染色，封片镜检， 棕黄色颗粒为阳性产物，400倍镜下，每个标本随机选取8个不重叠视野，用HPIAS—2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行分析，测定阳性颗粒的平均光密度(OD)值，半定量分析HO—1蛋白表达。肺组织切片HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。
1.4 统计学方法
, 百拇医药 采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组体质量、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.1 缺血后处理对PaO2的影响
PaO2的基础值各组差异无统计学意义(P>0.05)。与S组比较，I/R组、IPO组、HM+I/R组和ZnPPⅨ+IPO组术后PaO2明显降低；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组PaO2明显升高(P<0.05或0.01)，见表1。
2.2 缺血后处理对肺组织W/D、血清MDA含量和HO—1蛋白表达的影响
与S组比较，I/R组、IPO组、HM+I/R组和ZnPPⅨ+IPO组肺组织W/D、MDA含量增加(P<0.05)，HM+S组W/D和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组肺组织W/D、血清MDA含量降低(P<0.01)。I/R组、IPO组和HM+I/R组肺组织HO—1表达均明显高于S组(P<0.01)；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组肺组织HO—1表达增强，而ZnPPⅨ+IPO组明显减弱(P<0.05)。见表2、图1。, 百拇医药(江莹 夏中元 高瑾 徐金金 孟庆涛 侯家保)
肺缺血—再灌注损伤(IRI)是临床常见的病理生理现象之一，可发生于创伤、休克、心肺转流、肺移植和肺袖状切除等情况，因此，倍受相关学科关注[1—2]。缺血后处理(IPO)是指恢复血流时立刻给予一次或多次短暂重复预灌注/停灌注，能提高缺血器官对之前发生的较长时间缺血的耐受性[3—4]。血红素加氧酶(heme oxygenase， HO)是血红素降解过程中的限速酶，HO在应激条件下对机体具有保护作用，特别是HO—1高表达对器官IRI具有保护作用[5—6]；本科室前期研究已证实HO—1高表达对内毒素引起的急性肺损伤具有保护作用。研究表明，IPO可减轻心肌、肝脏、肾脏的IRI，但有关IPO对肺IRI的保护作用研究较少，HO—1是否参与了肺IPO的保护机制，目前尚不明确。本研究拟观察IPO对IRI肺组织HO—1的表达及肺损伤的影响，探讨IPO对肺IRI保护作用的机制，为临床中可能发生的肺缺血—再灌注损伤的预防和治疗研究提供参考。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验材料
氯化高铁血红素、锌原卟啉Ⅸ(Sigma公司，美国)，HO—1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，MDA测试盒(南京建成生物工程研究所)，DW—2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)，i—STAT临床血气分析仪(香港力新仪器有限公司)，OLYMPUS BX50显微摄影系统(OLYMPUS公司，日本)和HIPAS—2000型计算机图像分析软件(武汉千屏影像技术有限公司)。
1.2 动物分组及模型制备
本实验在武汉大学人民医院麻醉科实验室进行。SPF级SD大鼠48只，雌雄不拘，体质量(210±20 )g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。48只SD大鼠随机(随机数字法)分成6组(n=8)：假手术组(S组)、缺血—再灌注组(I/R组)、缺血后处理组(IPO组)、HO—1诱导剂氯化高铁血红素+缺血—再灌注组(HM+I/R组)、HO—1抑制剂锌原卟啉Ⅸ+缺血后处理组(ZnPPⅨ+IPO组)和HO—1诱导剂+假手术组(HM+S组)。实验前禁食12 h，自由饮水。7%水合氯醛5 ml/kg腹腔内注射麻醉，气管切开插管，连接呼吸机行机械通气。左侧股静脉插管、固定，以微量泵持续输注含有维库溴铵和晶胶比为3∶1的混合液，以微量泵输入芬太尼维持麻醉；右侧股动脉置管，持续监测平均动脉压和采血。经左侧第5肋间开胸，游离左肺门。推注肝素500 U/kg抗凝，于吸气末用无创血管夹闭左肺门，阻断左支气管及肺动、静脉(以肺无舒缩为阻断标准)，形成肺缺血模型。S组不缺血持续灌注150 min；I/R组缺血45 min，再灌注105 min；IPO组缺血45 min后，短暂预灌注30 s，停灌30 s，反复3次，再恢复灌注102 min；HM+I/R组于术前连续2 d腹腔注射氯化高铁血红素40 μmol/(kg·d)，手术操作同I/R组；ZnPPⅨ+IPO组于术前24 h腹腔注射锌原卟啉Ⅸ 20 mg/(kg·d)，后续操作同IPO组；HM+S组术前操作同HM+I/R组，术中同S组。术前无需给药的各组腹腔注射等剂量的生理盐水。
, 百拇医药
1.3 检测指标及方法
分别于机械通气20 min (T1)和实验结束前(T2)从股动脉采血立刻测定动脉血氧分压(PaO2)。实验结束后抽取股动脉血2 ml，4 ℃4000 r/min离心10 min，留取上清液，—70 ℃保存，按试剂盒说明用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量。留取左肺部分组织，80 ℃恒温箱烤24 h至肺干质量恒定，计算肺湿/干质量比(W/D)。取左肺叶0.5 cm ×0.5 cm组织，制作4 mm厚石蜡切片，SABC法染色，封片镜检， 棕黄色颗粒为阳性产物，400倍镜下，每个标本随机选取8个不重叠视野，用HPIAS—2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行分析，测定阳性颗粒的平均光密度(OD)值，半定量分析HO—1蛋白表达。肺组织切片HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。
1.4 统计学方法
, 百拇医药 采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组体质量、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.1 缺血后处理对PaO2的影响
PaO2的基础值各组差异无统计学意义(P>0.05)。与S组比较，I/R组、IPO组、HM+I/R组和ZnPPⅨ+IPO组术后PaO2明显降低；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组PaO2明显升高(P<0.05或0.01)，见表1。
2.2 缺血后处理对肺组织W/D、血清MDA含量和HO—1蛋白表达的影响
与S组比较，I/R组、IPO组、HM+I/R组和ZnPPⅨ+IPO组肺组织W/D、MDA含量增加(P<0.05)，HM+S组W/D和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组肺组织W/D、血清MDA含量降低(P<0.01)。I/R组、IPO组和HM+I/R组肺组织HO—1表达均明显高于S组(P<0.01)；与I/R组比较，IPO组和HM+I/R组肺组织HO—1表达增强，而ZnPPⅨ+IPO组明显减弱(P<0.05)。见表2、图1。, 百拇医药(江莹 夏中元 高瑾 徐金金 孟庆涛 侯家保)