不同复苏措施对猪心肺复苏后心肌凋亡的影响(3)
1.4 血流动力学和组织学
记录复苏前及复苏后30 min、1 h、2 h、6 h的血流动力学指标。主要包括心率、血压、平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)等。心肌标本常规电镜切片， 在透射电镜(HITACHI H-7650型，北京神经外科研究所电镜室)下观察。
1.5 Western-blot法检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白定量
配12%分离胶，并用dd H2O封胶，配 4%的浓缩胶灌胶，开始电泳。浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电泳电压为120 V。转膜完毕后，用TBS-T配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置4 h。用1%的封闭液将一抗Bax、Bcl-2和caspase-3分别按1∶500，1∶200和1∶500稀释，将膜与一抗一起孵育，4 ℃过夜。二抗孵育结束，TBS-T洗3次，每次5 min。使用ECL化学发光显色液，将显色后的膜或底片照相，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。
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1.6 实时荧光定量PCR法检测caspase-3 mRNA水平
按caspase3基因序列设计并合成引物， caspase-3 上游引物：5-CATGGCCTGTCAGAAAATAC-3，下游引物：5-TAACCCGAGTAAGAATGTGC-3；GAPDH 上游引物：5-GACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTA-3，下游引物：5-CTGTTTCAGGATTTAAGGTTGGAGATT-3。
反应体系： Mix 5 μl， cDNA 2 μl， 上/下游引物(10 pmol/L)1 μl， 2XSYBR Mix(含4 mmol/L Mg2+) 25 μl，反应总体积为10 μl。反应条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，扩增45个循环，60 ℃延伸结束时采集荧光信号，并作溶解曲线检测引物特异性。
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将各样本Ct值代入公式基因表达量 = 2-ΔΔCt计算， 其中ΔΔCt = [目的基因的平均Ct值(样本组)-管家基因的平均Ct值(样本组)]-[目的基因的平均Ct值(校正组)-管家基因的平均Ct值(校正组)]。
1.7 TUNEL法检测心肌组织凋亡
10%福尔马林固定后，石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白酶K消化，3%甲醇室温封闭后，加55 μl/5 cm的TDT酶， 37 ℃湿盒孵育60 min后， 60 μl/5 cm anti-digoxigenin conjugate，37 ℃湿盒孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察照相。
结果判断：凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规则，大小不一致。凋亡细胞指数计算：每张切片随机取5个高倍镜(×400)视野，采用双盲法分析图像，计算凋亡指数AI(%)=(凋亡阳性细胞数/ 视野中总细胞数)×100。
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1.8 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理， 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用成组t检验，多组均数比较用方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 复苏结果
复苏DF组和CF组各有2头动物在24 h之内死亡。DF与CF组比较，无论在除颤次数，除颤能量以及出现ROSC的时间上，DF组都少于CF组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 血流动力学
SHAM组、DF组和CF组各血流动力学指标在心搏骤停前差异无统计学意义，CPR组的MAP在复苏成功即时高于SHAM组，1 h持平，随后在ROSC 2 h MAP开始下降，在ROSC 2 h和6 h低于SHAM组，CPR组的CO在ROSC后随时间延长而下降，6 h降至最低，复苏后各观察点均低于SHAM组；并且CPR组间的DF组的MAP较CF组在ROSC后2 h下降趋势开始变缓，在6 h时更加明显。DF组的CO较CF组在ROSC后的30 min，2 h开始下降趋势变缓，在6 h时甚至开始出现上升的趋势。见图1。
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2.3 组织形态学
电镜下SHAM组心肌超微结构无损伤肌丝排列整齐，肌节Z线、M线清晰，核结构正常，核膜清晰，线粒体饱满，嵴密(图2A)；CPR组(DF和CF组)线粒体明显肿胀，空泡变性，嵴和外膜破坏，核周水肿明显，肌节Z线、M线断裂(图2B)，心肌损伤严重，肌丝排列紊乱、溶解、断裂(图2C)；可见大量心肌凋亡细胞，细胞核发生了核碎裂和核溶解现象，细胞浆和细胞核的边缘分辨不清(图2D)。
2.4 心肌细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白定量
CPR组的心肌细胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白定量分别是(0.196±0.017)、(0.739±0.081)和(0.790±0.263)，而SHAM组分别是(0.037±0.002)，(0.019±0.003)和(0.123±0.012)，CPR组比SHAM组明显增加(P<0.05)(图3B)，但是Bcl-2/Bax却在减少(图3C)；而CPR组间(DF和CF)的Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白定量的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 心肌细胞caspase-3 mRNA水平
CPR组(DF和CF组)的心肌细胞caspase-3的mRNA水平分别为(16.0±0.3)和(16.6±0.5)，较SHAM组明显升高(P<0.01)；而CPR组间(DF和CF组)的caspase-3的mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。
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记录复苏前及复苏后30 min、1 h、2 h、6 h的血流动力学指标。主要包括心率、血压、平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)等。心肌标本常规电镜切片， 在透射电镜(HITACHI H-7650型，北京神经外科研究所电镜室)下观察。
1.5 Western-blot法检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白定量
配12%分离胶，并用dd H2O封胶，配 4%的浓缩胶灌胶，开始电泳。浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电泳电压为120 V。转膜完毕后，用TBS-T配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置4 h。用1%的封闭液将一抗Bax、Bcl-2和caspase-3分别按1∶500，1∶200和1∶500稀释，将膜与一抗一起孵育，4 ℃过夜。二抗孵育结束，TBS-T洗3次，每次5 min。使用ECL化学发光显色液，将显色后的膜或底片照相，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。
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1.6 实时荧光定量PCR法检测caspase-3 mRNA水平
按caspase3基因序列设计并合成引物， caspase-3 上游引物：5-CATGGCCTGTCAGAAAATAC-3，下游引物：5-TAACCCGAGTAAGAATGTGC-3；GAPDH 上游引物：5-GACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTA-3，下游引物：5-CTGTTTCAGGATTTAAGGTTGGAGATT-3。
反应体系： Mix 5 μl， cDNA 2 μl， 上/下游引物(10 pmol/L)1 μl， 2XSYBR Mix(含4 mmol/L Mg2+) 25 μl，反应总体积为10 μl。反应条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，扩增45个循环，60 ℃延伸结束时采集荧光信号，并作溶解曲线检测引物特异性。
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将各样本Ct值代入公式基因表达量 = 2-ΔΔCt计算， 其中ΔΔCt = [目的基因的平均Ct值(样本组)-管家基因的平均Ct值(样本组)]-[目的基因的平均Ct值(校正组)-管家基因的平均Ct值(校正组)]。
1.7 TUNEL法检测心肌组织凋亡
10%福尔马林固定后，石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白酶K消化，3%甲醇室温封闭后，加55 μl/5 cm的TDT酶， 37 ℃湿盒孵育60 min后， 60 μl/5 cm anti-digoxigenin conjugate，37 ℃湿盒孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察照相。
结果判断：凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规则，大小不一致。凋亡细胞指数计算：每张切片随机取5个高倍镜(×400)视野，采用双盲法分析图像，计算凋亡指数AI(%)=(凋亡阳性细胞数/ 视野中总细胞数)×100。
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1.8 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理， 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用成组t检验，多组均数比较用方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 复苏结果
复苏DF组和CF组各有2头动物在24 h之内死亡。DF与CF组比较，无论在除颤次数，除颤能量以及出现ROSC的时间上，DF组都少于CF组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 血流动力学
SHAM组、DF组和CF组各血流动力学指标在心搏骤停前差异无统计学意义，CPR组的MAP在复苏成功即时高于SHAM组，1 h持平，随后在ROSC 2 h MAP开始下降，在ROSC 2 h和6 h低于SHAM组，CPR组的CO在ROSC后随时间延长而下降，6 h降至最低，复苏后各观察点均低于SHAM组；并且CPR组间的DF组的MAP较CF组在ROSC后2 h下降趋势开始变缓，在6 h时更加明显。DF组的CO较CF组在ROSC后的30 min，2 h开始下降趋势变缓，在6 h时甚至开始出现上升的趋势。见图1。
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2.3 组织形态学
电镜下SHAM组心肌超微结构无损伤肌丝排列整齐，肌节Z线、M线清晰，核结构正常，核膜清晰，线粒体饱满，嵴密(图2A)；CPR组(DF和CF组)线粒体明显肿胀，空泡变性，嵴和外膜破坏，核周水肿明显，肌节Z线、M线断裂(图2B)，心肌损伤严重，肌丝排列紊乱、溶解、断裂(图2C)；可见大量心肌凋亡细胞，细胞核发生了核碎裂和核溶解现象，细胞浆和细胞核的边缘分辨不清(图2D)。
2.4 心肌细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白定量
CPR组的心肌细胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白定量分别是(0.196±0.017)、(0.739±0.081)和(0.790±0.263)，而SHAM组分别是(0.037±0.002)，(0.019±0.003)和(0.123±0.012)，CPR组比SHAM组明显增加(P<0.05)(图3B)，但是Bcl-2/Bax却在减少(图3C)；而CPR组间(DF和CF)的Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白定量的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 心肌细胞caspase-3 mRNA水平
CPR组(DF和CF组)的心肌细胞caspase-3的mRNA水平分别为(16.0±0.3)和(16.6±0.5)，较SHAM组明显升高(P<0.01)；而CPR组间(DF和CF组)的caspase-3的mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。
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