急性冠脉综合征早期差异蛋白及其特异性和敏感性的研究(2)
【Key words】Acute coronary syndrome；Unstable angina；Early diagnosis；Proteomics；Micromolecule biomarker；Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)
我国急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)的发病率逐年升高，发病年龄逐渐提前，30岁左右发生急性心肌梗死的病例屡见不鲜，猝死病例逐渐增多。虽然目前已发现多种心肌损伤早期诊断标记物，但并没有减少急性心肌梗死或心源性猝死的发生[1-3]。原因为到目前为止尚无诊断不稳定心绞痛的特异性生物标志物，使得许多在心肌梗死或猝死发生前有相应症状的患者没有得到及时正确的诊断，错过了及时治疗的时机。蛋白质谱技术能快速发现差异蛋白，差异蛋白的发现可以为特异性的诊断生物标志物的发现与确定奠定基础[4-5]。因此，为寻找更为早期的急性冠脉综合征(acute coronary syndrome， ACS)特别是不稳定心绞痛(unstable angina，UA)的早期生物标志物，提高不稳定心绞痛的诊断率并及时干预治疗，以降低急性心肌梗死和心源性猝死的发病率，本研究应用蛋白质谱技术进行了急性冠脉综合征早期血清差异蛋白及其特异性、敏感性的研究。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
从自2008年10月以来收集的解放军306医院急诊确诊的ACS患者血清标本库中挑选出发病早期的患者血清标本31份，男性26例，女性5例，年龄34～80岁，平均61.84岁；其中不稳定心绞痛(UA)12例，非ST段抬高急性心肌梗死(NSTEMI)5例，ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)14例；上述病例诊断均符合中华医学会心血管分会制定的ACS诊断标准[6-7]。从出现症状到采血时间最短10 min，最长4 h，平均96 min。该组AMI患者采血时心肌损伤标志物(肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶)均尚未升高。对照组30例血清标本来自同期本院体检患者，男24例，女6例，年龄34～81岁，平均61.4岁，对照组有高血压病、糖尿病、高血脂、冠心病、脑血管病史及吸烟者等均与急性冠脉综合征组相匹配。
1.2 标本采集及保存
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ACS组及对照组均经静脉采血，离心5 min分离血清，血清标本及时分装后-70 ℃冰箱保存。
1.3 试剂和仪器
乙酸钠(NaAc)、高纯度离子水(HPLC级)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、白芥子酸(SPA)、尿素、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸盐表面活性剂(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、三羧甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-HCl)均购自美国Sigma公司。 BIOCK磁珠(BOC-WCX)购自北京伯奥克生物技术有限公司。飞行时间质谱分析仪(PBSIIC) 购自美国Ciphergen Biosystems公司。
1.4 差异蛋白检测步骤和方法
1.4.1 血清样本处理 血清标本均冰浴中解冻，10 000 r/min 4 ℃离心2 min。取血清10 μl与20 μl U9缓冲液(9 mol/L尿素，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCl，1% DTT)充分混匀变性，冰浴振荡30 min。上述变性后样本30 μl中加入50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5)370 μl混匀，使血清总稀释倍数达40倍。
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1.4.2 磁珠处理 100 μl磁珠装入EP管，置磁架上孵育2 min，弃上清液，加入50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5)100 μl平衡磁珠2次，每次5 min。取经过变性处理、稀释的血清100 μl加至平衡后的磁珠中，室温振荡反应30 min，置磁架上孵育2 min，弃上清液，以50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5) 100 μl清洗磁珠2次，每次5 min。再以洗脱液1%TFA洗涤磁珠2 min后， 取5 μl上清液与等量饱和SPA(1%TFA与等量CAN溶解SPA)混合，取3 μl混合液点样于金芯片，待自然干燥后行质谱仪检测。
1.4.3 质谱检测 质谱仪收集质荷比(即蛋白质质量和电荷的比值)为0～50 000的数据，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正质荷比。原始数据先以Proteinchip Software 3.0软件校正，使总离子强度及质荷比达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值为5，二次噪音过滤值为2，以10%为最小阈值进行聚类。仪器参数设置： 激光强度240，检测敏感度8。t检验比较两组血清蛋白质质谱数据(由Biomarker Wizard 3.2.0软件完成)，寻找出两组之间表达差异最为显著的蛋白质峰。
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1.5 特异性和敏感性的对比
两组血清均经日立7060全自动生化分析仪(日本日立公司)免疫比浊法检测高敏C反应蛋白(high-sensitive C reactive protein，hs-CRP)，钴结合法检测缺血修饰白蛋白(ischemiamodified albumin，IMA)，多功能免疫检测仪(美国瑞莱公司)双向测流免疫法检测心脏型脂肪酸结合蛋白(heart type fatty acid binding protein，H-FABP)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)。
1.6 统计学方法
计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 15.0软件作统计分析。LSD-t检验比较上述指标两组之间差异是否具有统计学意义。差异具有统计学意义的项目与筛选出的差异蛋白用受试者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲线进行特异性和敏感性的对比，计算ROC曲线下面积。
, http://www.100md.com(夏鹄 张军 刘利峰 宋海晶 冯凯 樊晓东 乔莉 金珊 路浩军)
我国急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)的发病率逐年升高，发病年龄逐渐提前，30岁左右发生急性心肌梗死的病例屡见不鲜，猝死病例逐渐增多。虽然目前已发现多种心肌损伤早期诊断标记物，但并没有减少急性心肌梗死或心源性猝死的发生[1-3]。原因为到目前为止尚无诊断不稳定心绞痛的特异性生物标志物，使得许多在心肌梗死或猝死发生前有相应症状的患者没有得到及时正确的诊断，错过了及时治疗的时机。蛋白质谱技术能快速发现差异蛋白，差异蛋白的发现可以为特异性的诊断生物标志物的发现与确定奠定基础[4-5]。因此，为寻找更为早期的急性冠脉综合征(acute coronary syndrome， ACS)特别是不稳定心绞痛(unstable angina，UA)的早期生物标志物，提高不稳定心绞痛的诊断率并及时干预治疗，以降低急性心肌梗死和心源性猝死的发病率，本研究应用蛋白质谱技术进行了急性冠脉综合征早期血清差异蛋白及其特异性、敏感性的研究。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
从自2008年10月以来收集的解放军306医院急诊确诊的ACS患者血清标本库中挑选出发病早期的患者血清标本31份，男性26例，女性5例，年龄34～80岁，平均61.84岁；其中不稳定心绞痛(UA)12例，非ST段抬高急性心肌梗死(NSTEMI)5例，ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)14例；上述病例诊断均符合中华医学会心血管分会制定的ACS诊断标准[6-7]。从出现症状到采血时间最短10 min，最长4 h，平均96 min。该组AMI患者采血时心肌损伤标志物(肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶)均尚未升高。对照组30例血清标本来自同期本院体检患者，男24例，女6例，年龄34～81岁，平均61.4岁，对照组有高血压病、糖尿病、高血脂、冠心病、脑血管病史及吸烟者等均与急性冠脉综合征组相匹配。
1.2 标本采集及保存
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ACS组及对照组均经静脉采血，离心5 min分离血清，血清标本及时分装后-70 ℃冰箱保存。
1.3 试剂和仪器
乙酸钠(NaAc)、高纯度离子水(HPLC级)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、白芥子酸(SPA)、尿素、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸盐表面活性剂(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、三羧甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-HCl)均购自美国Sigma公司。 BIOCK磁珠(BOC-WCX)购自北京伯奥克生物技术有限公司。飞行时间质谱分析仪(PBSIIC) 购自美国Ciphergen Biosystems公司。
1.4 差异蛋白检测步骤和方法
1.4.1 血清样本处理 血清标本均冰浴中解冻，10 000 r/min 4 ℃离心2 min。取血清10 μl与20 μl U9缓冲液(9 mol/L尿素，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCl，1% DTT)充分混匀变性，冰浴振荡30 min。上述变性后样本30 μl中加入50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5)370 μl混匀，使血清总稀释倍数达40倍。
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1.4.2 磁珠处理 100 μl磁珠装入EP管，置磁架上孵育2 min，弃上清液，加入50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5)100 μl平衡磁珠2次，每次5 min。取经过变性处理、稀释的血清100 μl加至平衡后的磁珠中，室温振荡反应30 min，置磁架上孵育2 min，弃上清液，以50 mmol/L NaAc溶液(pH=4.5) 100 μl清洗磁珠2次，每次5 min。再以洗脱液1%TFA洗涤磁珠2 min后， 取5 μl上清液与等量饱和SPA(1%TFA与等量CAN溶解SPA)混合，取3 μl混合液点样于金芯片，待自然干燥后行质谱仪检测。
1.4.3 质谱检测 质谱仪收集质荷比(即蛋白质质量和电荷的比值)为0～50 000的数据，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正质荷比。原始数据先以Proteinchip Software 3.0软件校正，使总离子强度及质荷比达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值为5，二次噪音过滤值为2，以10%为最小阈值进行聚类。仪器参数设置： 激光强度240，检测敏感度8。t检验比较两组血清蛋白质质谱数据(由Biomarker Wizard 3.2.0软件完成)，寻找出两组之间表达差异最为显著的蛋白质峰。
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1.5 特异性和敏感性的对比
两组血清均经日立7060全自动生化分析仪(日本日立公司)免疫比浊法检测高敏C反应蛋白(high-sensitive C reactive protein，hs-CRP)，钴结合法检测缺血修饰白蛋白(ischemiamodified albumin，IMA)，多功能免疫检测仪(美国瑞莱公司)双向测流免疫法检测心脏型脂肪酸结合蛋白(heart type fatty acid binding protein，H-FABP)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)。
1.6 统计学方法
计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 15.0软件作统计分析。LSD-t检验比较上述指标两组之间差异是否具有统计学意义。差异具有统计学意义的项目与筛选出的差异蛋白用受试者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲线进行特异性和敏感性的对比，计算ROC曲线下面积。
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