拮抗髓鞘抑制蛋白促进神经前体细胞分化的机制(3)
1.5 Western blot 分析PCI术后第35天,断颈处死大鼠、剥取梗死灶同侧新鲜海马液氮冻存。收齐标本后,加入添加了10%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的缓冲液(10 mmol/L Tris pH7.4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA),冰浴下匀浆,26 000×g在4 ℃离心30 min。取上清,用Bio-Rad DC 蛋白质定量测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)在分光光度计上进行蛋白质定量测定。SDS PAGE采用4%积层胶,12%分离胶,上样量为40 μg,电压12 V/cm,结束后取出凝胶电转移至同等大小的硝酸纤维素膜上,封闭1 h。加入单克隆抗体mouse anti-Notch1(1∶250, Chemicon)、rabbit anti-Neuro D(1∶100, Santa Cruz)、mouse anti-Mash1(1∶250, PharMingen),4 ℃过夜。TBST漂洗;联有辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase ......
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