邓方阁,李玉林

    骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力及多向分化潜能,在不同的诱导条件下,可向多种组织细胞分化[1-5]。目前,利用MSCs多向分化潜能及其可自体利用且无免疫排斥等特性,作为种子细胞用于组织工程学和基因工程学研究已成为热点。本研究在体外分离人骨髓血,利用密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养出人MSCs(human MSCs,hMSCs),分别利用3种不同的条件诱导培养基,诱导hMSCs向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞分化,为细胞移植、组织再生修复可能的自体来源提供理论基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂 Percoll(Pharmacia,Biotec,USA),LDMEM,HDMEM和10%胎牛血清(均Hyclone,USA),100 U/ml青链霉素双抗 (华北制药厂),0.125%～0.250%胰酶(Promega,USA),鼠抗人单克隆抗体 CD31、CD34、CD44、CD45、CD105(Neomarker,USA),地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxan- thine,IBMX)、抗坏血酸、β2甘油磷酸钠、阿扎胞苷(5-氮杂胞苷,5-azacitidine,5-Aza)、油红O(Sigma,USA)。

    1.2 人骨髓间充质干细胞的分离培养及免疫表型检测 方法同文献[6]所述,在无菌状态下取自愿捐献者的肝素化的穿刺骨髓血3～5 ml,利用Percoll(比重为1.073 g·ml-1)密度梯度离心,抽取单个核细胞层,用含青链霉素双抗(100 U/ml)的10%胎牛血清的L-DMEM 重悬细胞,计数以(3～4)×106的细胞密度接种在6孔板中进行培养。接种后3 d首次换液,每隔3～4 d换液一次。当原代细胞接近汇流(>80%融合)时,0.25%胰酶消化传代培养,取生长状态良好的传代hMSCs用于后续研究。胰酶消化收集细胞,1×106个/mL细胞与一抗单克隆抗体 CD31 、CD34、CD44、CD45、CD105 孵育液常温下孵育30～40 min ......