保 莉,田大成,郑亚莉

    (宁夏人民医院肾内科,银川 750001)

    在肾小球硬化(glomerulosclerosis,GS)进展的过程中,足细胞的减少是反映肾小球损伤程度的预测及观测指标。足细胞特异性分子nephrin及肿瘤蛋白-1(Wilms’ tumor-1,WT-1)的表达变化均会影响足细胞的结构和功能,导致足突融合,足细胞脱落,进而发生GS[1-4]。

    为了系统地观察足细胞损伤在GS发展过程中的重要作用,本研究使用的嘌罗霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)肾炎模型,通过观察其临床指标、病理形态及nephrin和WT-1的表达在GS过程中的改变,探讨足细胞损伤在GS过程中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    雄性SD大鼠(宁夏医科大学动物实验中心),体质量200～220g,随机分为对照组与PAN组,PAN组大鼠尾静脉注射PAN(15mg/kg,Sigma公司,美国),尿蛋白阳性即为造模成功。对照组同法注射等量生理盐水。分别于第4,8天和4,14,20周测定大鼠收缩压、血脂、血肌酐、血浆白蛋白、24h尿蛋白定量等指标,并于上述时间点处死大鼠,取其肾脏,石蜡包埋,切片。

    1.2 过碘酸雪夫染色、肾小球硬化指数及肾小球面积的测定

    切片行常规过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色,对每个肾小球进行半定量评分(0～4分)[5],标准如下：0分为正常；0.25分是球囊粘连；0.5分是GS面积占肾小球总面积<10%；1分表示占10%～25%；2分是占26%～50%；3分是占51%～75%；4分是占76%～100%。肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index,GSI)是每一张切片在光学显微镜40倍下可见的所有肾小球总分的平均值。GSI＝[(1×nl+2×n2+3×n3)/每张肾小球总数]×100%。依照Bertram[6]的方法,PAS染色切片在光镜下拍照,运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件自动测定肾小球面积(glomerular area,GA)。

    1.3 nephrin和WT-1免疫组化染色及表达的测定

    4μm肾组织切片脱蜡至水,柠檬酸盐抗原修复,过氧化氢室温孵育,加入兔抗鼠nephrin抗体(1∶100,Abcam公司,美国)及WT-1抗体(1∶100,Santa Cruz公司,美国)孵育(4℃冰箱过夜),PBS冲洗,山羊抗兔IgG室温孵育,PBS冲洗,按照免疫组化二步法步骤操作(北京中杉金桥生物技术有限公司) ......