王 越，王士博，于晓雯，杨 玲，拓西平

    胎鼠海马神经元培养方法的改进及鉴定

    王 越，王士博，于晓雯，杨 玲，拓西平*

    (第二军医大学附属长海医院老年病科，上海 200433)

    优化海马神经元原代培养方法。取孕17～18d胎鼠海马，经过剪碎、消化、离心和吹打过滤后种板，根据孵育后更换为无血清培养基的时间不同分为A组和B组。A组4h后更换，B组12h后更换。观察并记录第2、3、4、5天两组神经元生长状况，并于第7d用神经元特异性烯醇化酶荧光染色法鉴定神经元，计算其纯度。(1)4～6h后细胞已贴壁生长，2d后胞体增大，3d时突起长出，5d后突起变长变粗并有分支形成，相互连接呈网状。(2)7d后行免疫荧光染色，为阳性结果，证实为神经元，且A组神经元纯度显著高于B组(<0.05)。改进后的方法可培养出生长状况良好且纯度更高的神经元。

    神经元；培养；胎鼠

    医学科研工作离不开相关的疾病模型，用于探究神经元功能障碍和退化机制的模型主要有动物和细胞培养模型两种。动物模型可用于神经元发育[1]和退化方面[2]的研究，但由于神经系统内在的复杂性，无法从分子学、生物学和结构观察上进行详细的研究。原代神经元培养所形成的细胞模型可弥补这方面的缺陷，是进行深入研究的合适工具。本研究在传统培养方法的基础上，通过实验进一步改进完善，建立了一种简单可行的原代神经元培养方法，可进一步应用于制造神经系统疾病细胞模型。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    孕龄17～18d的SD大鼠，由第二军医大学实验动物中心提供。特级胎牛血清(BIOSUN公司)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)、Neurobasal Medium、B27添加剂(均Gibco公司)，胰蛋白酶和多聚?L?赖氨酸(均Sigma公司)，青霉素?链霉素溶液(双抗；HyClone公司，4’,6?二脒基?2?苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)一抗和荧光二抗(均谷歌生物公司)。

    1.2 原代培养

    1.2.1 培养板的预处理 海马取材前将无菌盖玻片放入6孔板内，用0.1mg/ml的多聚赖氨酸包被6孔板，置于37℃，5%CO2孵箱内，2h后吸出多余多聚赖氨酸，无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline ......