刘 佳，秦留安，席少枝，刘 军，王绪云，李晓琪，杨 洁，尹 彤

    (解放军总医院心内科，北京 100853)

    维生素K循环是机体内维生素K依赖性凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)活化的重要通路，环氧型维生素K经维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR，编码基因VKORC1)转变为维生素K，然后在VKOR的作用下，转化为还原型维生素K，参与维生素K依赖性凝血因子的羧化反应[1]。由于维生素K循环是通过少量维生素K的反复利用，实现维生素K的氧化还原和γ羧化，因此，肝脏维生素K循环中的维生素K含量的稳态对凝血因子活化反应的影响更直接和显著。近年研究表明，在维生素K循环中，细胞色素P450家族的成员CYP4F2具有氧化水解维生素K的功能[1]，因此，CYP4F2有可能通过改变维生素K循环中维生素K含量的稳态影响凝血因子的活化，从而发挥其对凝血功能的影响。我们前期针对维生素K拮抗剂华法林的药物基因组学研究发现，在维生素K代谢和循环通路上的候选基因(VKORC1、GGCX、CYP4F2、EPHX1、APOE、NQO1、CALU)中，只有CYP4F2基因变异型与华法林出血并发症相关。经校正维生素K摄取等临床环境因素和已知相关基因变异因素(CYP2C9*3)后[2，3]，其中携带CYP4F2rs3093168 CC基因型患者发生严重出血并发症的风险是非携带者的7.61倍[4]，提示CYP4F2基因是影响华法林出血并发症的重要相关基因，其作用机制可能与CYP4F2参与影响凝血因子的活化密切相关。尽管如此，目前尚未见CYP4F2对维生素K依赖性凝血因子活性影响的相关文献报道。鉴于此，本研究以维生素依赖性凝血因子FⅨ活性的改变为例，通过在人肝细胞系LO2细胞中过表达CYP4F2和凝血因子FⅨ，探讨CYP4F2对维生素K依赖性凝血因子活化的影响，以期为基于药物基因组学的维生素K拮抗剂个体化抗凝治疗提供新的生物功能依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    携带人CYP4F2-cDNA的pCR4Zero质粒[5]和携带人凝血因子FⅨ-cDNA的pIRES质粒[6]分别由美国密西西比大学医学中心Stec教授和德国乌尔茨堡大学人遗传学研究所Czogalla教授惠赠。人正常肝脏细胞系LO2细胞购自军事医学科学院细胞库。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、1640细胞培养基、胎牛血清及Lipofectamine 2000 转染试剂为 Invitrogen 公司产品。XbaⅠ与SalⅠ核酸限制性内切酶购自TAKARA公司 ......