徐婉莹,查志敏,汤金梅

    (1苏州市第九人民医院老年医学科,江苏 苏州 215000;2南京医科大学第一附属医院老年医学科,南京 210029)

    晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products,AGEs)是还原糖与核酸、蛋白质之间经过非酶促反应后进一步重排形成的不可逆终产物[1],参与了众多疾病如糖尿病、癌症、心血管疾病及衰老等过程,沉默信息调节因子3(silentmatingtypeinformationregulation2homolog-3,Sirt3)是存在于线粒体内与维持线粒体氧化还原稳态密切相关的蛋白脱乙酰酶[2],和心脏肥厚、肾损伤、骨关节炎等发病机制相关[3],久坐不动的老年人与年轻人相比Sirt3水平减少了40%[4]。本实验研究原代心肌细胞中Sirt3改变是否参与AGEs致心肌衰老的过程。黄山药总皂苷(total saponins of dioscorea pathaica,TSDP)是薯蓣科植物黄山药根茎中提取物,主要成分为甾体皂苷类,具有治疗心肌缺血、降血脂和抗肿瘤等作用,本团队前期研究其保护作用可能与Sirt3升高相关,本实验将进一步探讨其中机制。

    1 材料与方法

    1.1 研究材料

    出生1～3d清洁级SD乳大鼠购于南京青龙山动物养殖场;高糖培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)及Ⅱ型胶原酶购于美国Sigma公司;AGEs(ab51995)购于美国Abcam公司;胎牛血清,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)购于美国Gibco公司;p16、p53抗体购于中国Proteintech公司;SIRT3及超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2,SOD2)抗体购于美国CST公司;Sirt3 siRNA购于中国吉玛基因公司;SA-β-Gal染色试剂盒及活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购于上海碧云天公司;TSDP提取物原粉购于成都地奥制药公司。

    1.2 方法

    1.2.1 分离与培养原代心肌细胞 取SD乳大鼠,在无菌条件下剪开胸壁取出心脏,马上放于无菌预冷的PBS中清洗3次,随后剪碎,在0.1%的Ⅱ型胶原酶中反复消化7次,每次消化6min,把每次消化后的液体收集后滴入含有完全培养基和血清的终止液里。将所有收集溶液于4℃,1000转/min离心机中离心10min,吸弃上清,加入含有10%的胎牛血清的DMEM培养基中重悬,随后铺板在10cm培养皿中,放置在37℃温箱中共1.5h,所收集的上清液含有心肌细胞,用枪吹匀,在6孔板中铺板,继续培养48h ......