左旋卡尼汀对兔缺血／再灌注心肌细胞死亡及心脏功能的影响
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[摘要]目的 探讨左旋卡尼汀对心肌缺血/再灌注(MI/R)后心肌细胞死亡(坏死和凋亡)及心脏功能的影响。 方法 制备家兔MI/R模型，缺血45min，再灌注3h。25只家兔随机分为3组:对照组(Ⅰ组，n=5)，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎;MI/R组(Ⅱ组，n=10)，MI后5min静脉滴注生理盐水至实验结束;左旋卡尼汀治疗组(Ⅲ组，n=10)，在缺血后5min静脉滴注左旋卡尼汀(1.5ml·kg -1 ·h -1 )加生理盐水至实验结束。观察心率、左室压等的变化，再灌注结束后检测心肌梗死或用原位末端TUNEL法检测细胞凋亡指数，心肌组织游离脂肪酸(FFA)含量。 结果 MI/R造成明显的心脏功能障碍，心肌梗死和缺血区细胞凋亡，组织FFA含量增多。与Ⅱ组比较，Ⅲ组的梗死面积明显缩小(P<0.05)，凋亡指数减少(P<0.05)，FFA减少(P<0.05)及促进再灌注后心脏收缩舒张功能恢复。 结论 左旋卡尼汀可减少心肌梗死范围，其促进缺血心脏功能恢复的作用可能系通过抑制缺血心肌细胞凋亡而实现。
[关键词] 左旋卡尼汀;再灌注损伤;心肌缺血;脱噬作用;兔
Effects of L-carnitine on cardiac myocyte death and post-ischemic cardiac function recovery
MA Lan-xiang，JIA Guo-liang，ZHAO Xin-guo，ZHANG Qing
(Department of Cardiology，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China)
Abstract:Objective To study the effects of L-carnitine on cardiac myocyte death(necrosis and apop-tosis)and cardiac function recovery following myocardial ischemia/reperfusion(MI/R).Methods Rabbits were subjected to45min myocardial ischemia followed by reperfusion for3h.Anesthetized rabbits were randomly divided into3groups:control group(n=5)in which left anterior descending coronary artery was exposed and a piece of silk thread was placed around the artery but not tied;MI/R group(n=10)in which normal saline1.5ml was injected into sublingual vein after MI;L-carnitine group(n=10)received intra-venous L-carnitine1.5ml·kg -1 ·h -1 5min after MI.Arterial blood pressure，ECG and left ventricular pres-sure were monitored throughout the experiment.Apoptosis was identified by TUNEL，apoptosis index(AI)was obtained and myocardial infarction and myocardial FFA were determined at the end of reperfusion.Re-sults MI/R caused significant cardiac dysfunction and myocardial death，and increased myocardial FFA.Compared with the MI/R group，the L-carnitine group showed protection against MI/R injury as evidenced by reduced myocardial infarction(P<0.05)，marked decrease of AI(P<0.05)and FFA，and improved re-covery of cardiac systolic/diastolic function at the end of reperfusion.Conclusion Through its anti-apoptot-ic effect，L-carnitine exerts L-cardioprotective effect against postischemic myocardial injury.
Key words:L-carnitine;reperfusion injury;myocardial ischemia;apoptosis;rabbits
卡尼汀，又名肉毒碱，是脂肪酸代谢的必需辅助因子，可加速脂肪的β.氧化，提高三磷酸腺苷(ATP)水平，能改善心肌缺血时的异常代谢状况。左旋卡尼汀作为一种有效的氧自由基清除剂，在缓解氧化应激、减少脂质过氧化中均具有明显的保护作用 [1] 。近年来对卡尼汀研究的新发现 [2] ，提示卡尼汀在对缺血性心脏病的作用中，除了优化心肌能量代谢外，抑制MI/R心肌细胞凋亡可能是保护缺血/再灌注心肌的重要机制。本实验通过在体兔缺血/再灌注(MI/R)模型，探讨左旋卡尼汀对MI/R心肌细胞的保护作用及其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
健康家兔25只，雌雄不限，体重2.5～3kg(第四军医大学实验动物中心提供)，随机分为3组。Ⅰ组为空白对照组(n=5)，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎;Ⅱ组(n=10)，MI后5min静脉滴注生理盐水至实验结束。Ⅲ组为卡尼汀治疗组(n=10)，在同Ⅱ组处理的基础上加注左旋卡尼汀1.5mg·kg -1 ·h -1 。1.2 实验材料及仪器左旋卡尼汀(常州三位工业技术研究所研制);伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma公司;In Situ Cell Death Detection POD试剂盒为德国宝丽曼公司产品;游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);八道生理记录仪RM-6000(日本光电公司);微量注射泵WZ-50B(浙江医科大学仪器厂)。
1.3 心肌缺血再灌注模型的制备
3%戊巴比妥钠(30mg·kg -1 )腹腔麻醉，颈部居中切开。分离左侧颈总动静脉，由左侧颈总动脉插管至左心室，通过压力换能器连接八导生理记录仪，测左心室收缩内压(LVSP)和左室内压最大变化速率(dp/dt max )等心功能指标，颈静脉插管连接输液泵。同步记录心电图观察ST变化。心肌缺血再灌注模型参照simpsond的方法并加以改进，开胸、暴露心脏，于冠脉左室支中1/2处穿线环绕之，将结扎线两端均穿入一长约4～5cm的硅胶管腔内，在心电血压监测下将结扎线向外收紧，造成急性心肌缺血，45min后放松结扎线使冠状动脉再通形成再灌注。成功标准:结扎后Ⅱ导联ST段出现弓背向上抬高、T波高耸等表现为缺血成功。放松结扎线后，抬高的ST段出现下降1/2以上为再灌注成功。符合该标准者始入选试验。如出现下列情况的动物均剔除:冠脉结扎失败，未结扎冠脉之前出现各种心律失常，收缩压<9.31kPa并持续5min。各组中用以心肌梗死范围和细胞凋亡检测的心脏各半。
1.4 记录血流动力学指标
分别在正常状态下，缺血40min，再灌注30min，3h记录等容收缩期左室内收缩压峰值(PLVSP)，左室内压最大上升速率[(+dp/dt) max ]，左室内压最大下降速率[(-dp/dt) max ]。
1.5 测定FFA含量
实验结束后即刻分别取缺血区及正常供血区左心室心肌组织1.0g，低温状态下用生理盐水冲洗干净，制成心肌匀浆液，离心后取上清液，按试剂盒说明书操作。
1.6 测量心肌梗死范围
再灌注3h后，将冠状动脉左室支原位重新结扎，从颈动脉注入10g·L -1 伊文思蓝5ml，待缺血区显示清晰后(未蓝染)立即摘除心脏，冰冷生理盐水冲洗后留左室，-20℃左右冷冻10min，作垂直左室长轴连续环切，每片厚2～3mm，以TTC法染色，用IBAS全自动处理系统计算各部位面积。以各片缺血区面积之和占各片左室壁面积之和的百分率作为缺血区范围，心肌梗死范围以每一心脏总梗死面积占总缺血面积的百分率表示。
1.7 细胞凋亡检测及凋亡率
再灌注3h结束后，分离左心室心肌，取缺血区心肌组织，用10%甲醛液固定24h，经各级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋连续切片6μm，采用末端标记TUNEL法检测心肌细胞凋亡。按照试剂盒说明书操作。每一心脏取3张切片，在高倍镜下(10目镜×40物镜)检测，于凋亡阳性细胞区域随机选择10个视野，对凋亡阳性细胞计数并行计算机图像分析，作半定量测定，以心肌凋亡细胞占总心肌细胞数的百分率作为心肌细胞凋亡指数(AI)。
1.8 统计学处理
实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，若总体差异显著，再用S.N.K检验分析相应两组间显著性差异。P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 血流动力学指标
各处理组动物的血流动力学指标在缺血前未见显著性差异。缺血后家兔室内压及其微分均出现降低，但各组间差异无显著性。再灌注3h后，与Ⅱ组相比，Ⅲ组心率无显著性差异，LVEDP明显降低(P<0.05)，±LVdp/dt max 明显增大(P<0.05)。以上结果说明，左旋卡尼汀可促进MI/R兔心脏功能的恢复。见表1。
表1 不同处理方法对兔缺血45min、再灌注3h后心脏功能的影响(略)
注:1mmHg=0.133kPa 与MI/R组比较，* P<0.05
3.2 FFA含量的变化
与Ⅰ组比较，Ⅱ组心肌组织FFA含量明显增多(P<0.05)，Ⅲ组与Ⅱ组比较FFA显著减少(P<0.05)，与Ⅰ组比较无显著性差异(P>0.05)。见图1。
Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组
图1 不同处理组FFA活性变化(略)
3.3 心肌梗死范围的变化
经伊文思蓝染色确定，Ⅱ组和Ⅲ组之间总缺血范围无明显差异(P>0.05)，分别为(51.6±7.23)%、(48.2±9.27)%;Ⅲ组心肌梗死面积为(42.9±4.33)%，与Ⅱ组的面积(54.4±4.27)%比较，梗死面积明显缩小(P<0.05)。
3.4 心肌细胞AI变化
经TUNEL染色，凋亡细胞的核呈深棕色，非凋亡细胞的胞核不着色。正常心肌和梗死中心区无凋亡细胞，而在梗死周围心肌中有散在大量凋亡细胞，与Ⅱ组(2.24±0.35)比较，Ⅲ组AI(1.23±2.68)明显减少(P<0.05)。
4 讨论
缺血性心脏病是严重威胁人类健康的疾病，采用溶栓术等恢复缺血心肌血液再灌注是目前临床救治急性心肌梗死(AMI)的主要措施。近期的大规模临床试验CEMID的结果提示，左旋卡尼汀可明显改善心肌梗死后患者的心功能，降低死亡率，缩小梗死面积 [3] 。与溶栓治疗相比，左旋卡尼汀价廉、简便、无特殊禁忌证及毒副作用，适合广泛应用于AMI的治疗。但关于左旋卡尼汀对MI/R心肌的具体作用及其机制仍不完全清楚。
左旋卡尼汀本身并不是机体的基本营养素，是脂肪酸进入线粒体进行β.氧化所必需的辅助因子，可加速转运长链脂肪酸通过线粒体内膜，进入线粒体进行β氧化供能。充裕的左旋卡尼汀可使缺血心肌从糖酵解转向脂肪酸氧化，使心肌细胞内能量代谢得以恢复，同时左旋卡尼汀亦可减少脂肪酸代谢产物在心肌细胞内的堆积，使心肌损伤减轻 [4] 。朱光旭等 [5] 就左旋卡尼汀对心肌细胞保护作用的机制进行研究，认为左旋卡尼汀的心肌保护作用是通过减少DNA断片率、NRF1和减少mtTFA mRNA表达下调来实现。国外学者研究表明卡尼汀能阻止骨骼肌细胞的凋亡 [2] ，但是否对心肌缺血/再灌注后细胞凋亡有影响，目前研究进行得很少。针对这种情况，本实验制备家兔在体缺血/再灌注模型，观察左旋卡尼汀对心肌缺血/再灌注损伤的影响，认为其保护作用是通过抑制细胞凋亡来实现的。
引起再灌注损伤的主要因素，目前认为与Ca 2+ 超载 [6] 、氧自由基 [7] 和白细胞聚积有关。在亚细胞水平上，氧自由基通过破坏细胞器膜双层磷脂结构中的重要脂类，进而引起溶酶体及线粒体的破裂，以及通过引起活性白细胞在微血管中聚集，造成微循环障碍，引发进一步的组织损伤。此外，已有多项研究报道显示，氧自由基通过启动bcl-2 [8] 、TNF-α [9] 多种细胞凋亡相关因素，诱导细胞发生凋亡。
本实验观察到MI/R造成明显的心脏功能障碍，心肌梗死和缺血区细胞凋亡及组织游离脂肪酸(FFA)含量增多。心肌再灌注早期给予左旋卡尼汀，可明显缩小家兔心肌缺血/再灌注过程中的心肌梗死面积，降低细胞凋亡指数及心肌组织中FFA含量，改善再灌注后心肌收缩及舒张功能。表明左旋卡尼汀能抑制心肌缺血/再灌注过程中细胞凋亡的发生，并提示在心肌缺血/再灌注损伤中，细胞凋亡是可以预防的。验证了左旋卡尼汀抑制心肌细胞凋亡可能是保护缺血/再灌注心肌的重要机制这一假设。
至于左旋卡尼汀如何抑制缺血/再灌注心肌细胞发生凋亡，目前尚无定论。可能的解释为:心肌缺血后，脂肪酸，如棕榈酸盐在血浆和心肌组织中生成增多，而棕榈酸盐被认为能促进心肌细胞凋亡 [10] ，棕榈酸盐通过调控棕榈酰激酶(palmitoyl-COA)介导的线粒体膜通透性的变化在细胞凋亡中发挥作用 [11] 。因此，左旋卡尼汀减少脂肪酸生成可能是抗细胞凋亡的 一个重要环节。另外左旋卡尼汀可能通过提高SOD活性，减轻细胞内Ca 2+ 超载，减少氧自由基生成、增强细胞抗氧化损伤能力来减少凋亡事件的发生，从而发挥其抗氧化、抗凋亡的细胞保护作用。
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[作者简介] 马兰香(1971-)，女，陕西延安人，主治医师。
(第四军医大学西京医院心血管内科，陕西西安 710032)
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