大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定
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[摘要]目的 研究肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化形成机制，建立一套经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞的方法。 方法 采用胶原酶、链霉蛋白酶循环灌流法分离大鼠的肝星状细胞，18%Nycodenz密度梯度离心纯化肝星状细胞，采用免疫组织化学方法鉴定Desmin阳性细胞的纯度。 结果 每只鼠肝约获取3.6×10 7 个星状细胞，活率、纯度平均为95.4%、95%。 结论 本方法建立了有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。
[关键词] 肝星状细胞;灌流;分离培养;大鼠
Culture and identification of the rat hepatic stellate cells
WU Ting，TENG Gao.jun
(Department of Radiology，The Affiliated Brain Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing210029，China;Department of Radiology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the mechanism of matrix accumulation and hepatic fibrosis，and to de-velop an economic，simple and reliable method for isolation of hepatic stellate cells(HSCs)in rats.Methods HSCs were isolated from liver of rat by perfusion with pronase and collagenase，and were separated from other cells by density gradient centrifugation with18%Nycodenz.The purity of HSCs was identified by the expression of desmin using immunocytochemistry method.Results The yield HSCs of rats was3.6×107per rat.The cell via-bility was95.4%，and the purity of cell was95%.Conclusion This method for isolating and culturing HSCs is efficient.
Key words:hepatic stellate cells;perfusion;isolated culture;rats
1876年德国人Kupffer在研究肝的神经系统时，用氯化金浸染的方法发现，在肝毛细血管的周围存在一种星形的细胞，星状细胞又先后被称为肝贮脂细胞、Ito细胞、维生素A贮存细胞、窦膜细胞等二十多个不同的名称。1996年美国肝病会议将其正式命名为肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)[1] 。20世纪80年代初Knook等[2] 用胶原酶、链霉蛋白酶原位循环灌注法首先成功地分离了大鼠肝星状细胞，从此人们开始了肝星状细胞的研究。肝损伤后肝星状细胞活化能合成大量细胞外基质，同时产生基质金属蛋白酶，是组织间质增生的细胞学基础[3，4] 。HSCs成为研究肝损伤后纤维化形成的中心环节，然而由于其分离方法步骤繁琐、条件严格，初学者不易获得成功，作者参考中外文献，经过多次实验，摸索出一套稳定、经济的分离方法，现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
选用河南医科大学实验动物中心提供的健康Wistar大鼠，雄性，体重(400±50)g，普通食物喂养，自由进食。
1.1.2 主要试剂
Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz、内皮素.I(Endothelin.I)均为美国Sigma公司产品，DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品，鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品，其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器设备
蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、倒置相差显微镜、多功能动物手术台等。
1.2 实验方法
1.2.1 肝星状细胞的分离制备
肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法[4] ，大鼠术前禁食12～16h，自由饮水。用1%戊巴比妥钠40mg·kg-1 腹腔内注射麻醉大鼠。胸腹部皮肤消毒，移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔，分离下腔静脉及门静脉，在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口，迅速插入自制血管插管，结扎固定。接通恒流蠕动泵，灌注预热37℃的D.Hank's肝脏灌流液，剪开下腔静脉，此时可见灌流液自下腔静脉流出，肝脏逐渐饱满，由紫红色逐渐变成淡黄白色。游离肝脏，保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。
将游离之肝脏置于平皿中，灌注预热37℃的含酶Hank's液Ⅰ(含0.05%的胶原酶、0.1%链霉蛋白酶溶液)，并将灌注系统进液端放入平皿中，使流出的酶液可进行循环灌流，可见肝脏变软无弹性，肝包膜下出现小液泡。倒除灌流液，撕去肝脏外膜，撕碎或剪碎肝组织，加入预热37℃的含酶Hank's液Ⅱ(含0.05%的胶原酶、0.02%链霉蛋白酶、0.01%DNA酶Ⅰ溶液)，再次消化20min。经200目滤网过滤，用磨锤轻轻研磨，并用4℃的Hank's液冲冼。将烧杯内细胞悬液分装入2只50ml的刻度离心管，550r·min-1 离心8min;吸除上清入2只50ml的刻度离心管，1750r·min-1 离心8min。去上清，用4℃的Hank's液冲冼重悬，2管合1定容至10ml。加入20ml的18%Nycodenz，将细胞悬液分装入6只10ml带盖的刻度离心管中，每管液面覆盖2～3ml的Hank's液，3200r·min-1 离心15min。吸取中间细胞悬液层入50ml刻度离心管，加入无血清DMEM培养液至50ml，550r·min -1 离心8min，取沉淀。加入预热37℃的含血清的DMEM完全培养基至10ml。
1.2.2 肝星状细胞的鉴定
1.2.2.1 新鲜肝星状细胞产量测定 倒置相差显微 镜下，使用血细胞计数板计数肝星状细胞产量。
1.2.2.2 肝星状细胞活力的鉴定 常规台盼蓝拒染法。
1.2.2.3 肝星状细胞性质的鉴定 (1)光镜下观察新分离的肝星状细胞含有丰富的脂滴，细胞透光度增加。(2)维生素A自发荧光鉴定:荧光显微镜下观察，在328nm波长的紫外光激发下，新分离的肝星状细胞能发出蓝绿色的自发荧光，但在数秒内迅速减退。(3)免疫组织化学(简称免疫组化)法鉴定Desmin阳性的细胞:用鼠抗人Desmin抗体，SP法做免疫细胞化学染色。(4)肝星状细胞纯度的鉴定:倒置显微镜下于细胞片上随机数200个细胞，计数Desmin染色胞浆黄色的细胞，并计算纯度。肝星状细胞纯度(%)=Desmin阳性的细胞.细胞总数×100%。
1.2.3 肝星状细胞的培养
1.2.3.1 原代培养 用含20%(体积分数)胎牛血清的DMEM完全培养基稀释细胞悬液，留取少量的细胞进行细胞纯度及活力鉴定。以1×10 5 ～1×10 6 ml -1 的密度接种到50ml塑料培养瓶中，在37℃、体积分数为5%CO 2 、95%潮湿空气的CO 2 恒温培养箱里培养。培养瓶内细胞24h后首次换新鲜DMEM培养液，以后每3d换液1次，培养液改为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。
1.2.3.2 传代培养 原代培养星状细胞长满单层后，吸去培养基，0.25%胰蛋白酶于37℃消化10～15min。等细胞附着松动，显微镜下观察细胞质边缘卷起，间隔加大，便终止消化。吸去胰蛋白酶，用Hanks液清洗1次。加入3ml DMEM，反复吹打培养瓶壁制成单个细胞悬液，收集细胞悬液，1500r·min -1 离心10min，离心2次后加入含10%胎牛血清的DMEM重悬，以2×10 5 ml -1 浓度接种。
2 结果
2.1 新鲜肝星状细胞产量、纯度、活率
本试验采用门静脉—下腔静脉插管，胶原酶、链霉蛋白酶原位循环灌流消化肝脏，经梯度离心法分离SD大鼠肝星状细胞，平均每只大鼠体重400g，每只鼠肝约获取3.6×10 7 个星状细胞，活率、纯度平均为95.4%、95%。
2.2 肝星状细胞形态学观察
在倒置显微镜下观察到细胞悬液中含有许多单个细胞及少量细胞团，新分离未贴壁的活肝星状细胞胞浆中含较多脂滴，呈透亮、折光性很强的球形、圆形细胞，远小于肝细胞。细胞核位于细胞正中，细胞边界轮廓清晰。培养24h可见细胞贴壁，呈扁圆形，部分细胞开始伸展。48h后已呈现出星状外形的典型表现。7d后细胞逐渐开始融合、变长、分裂、增殖，形态向纤维样细胞发展，但胞体仍较大，细胞浆内折光颗粒减少，部分细胞融合成片状。经过约14d的原代细胞培养，细胞长成单层，铺满瓶底。0.25%胰蛋白酶消化传代后，3h内细胞很快贴壁，少量伸出伪足，24h后细胞全部伸展生长;3d后呈肌成纤维样细胞，生长较快，约7d后又可长成单层。传代后细胞又可继续生长，可维持传代5代以上。随着传代次数增多，细胞呈典型的成纤维细胞特征，胞浆内折光颗粒逐渐消失。见图1～3。
2.3 肝星状细胞的性质鉴定
光镜下新分离未贴壁的活肝星状细胞浆中含丰富的脂滴，折光性极强。部分新鲜分离得到的肝星状细胞在327nm波长下具蓝绿色荧光，但极易猝灭。原代培养第7d的Desmin阳性细胞在90%以上，传代细胞的Desmin阳性率达100%。见图4。
图1 光镜下新鲜分离的HSCs ×100 细胞呈圆形，胞浆中含较多的折光颗粒(略)
图3 光镜下传代3d的HSCs ×400 转变为肌成纤维样细胞(略)
图2 光镜下培养7d的HSCs ×100 向纤维样细胞发展，细胞浆内折光颗粒减少(略)
图4 光镜下传代的HSCs ×100 Desmin染色阳性(略)
3 讨论
本试验参照Friedman等[5] 的方法，并对其进行改良成功地分离了大鼠的肝星状细胞。国内一些作者采用原位灌流法分离HSCs，酶的用量较大，且因肝与膈肌之间侧支循环较多，难以掌握酶灌流的时间及速度;本法采用离体胶原酶、链霉蛋白酶灌注法，每只大鼠肝脏约获得星状细胞1×10 7 个。提高细胞得率主要应注意以下方面:(1)一般选用体重400g左右、营养状况良好的大鼠较为合适。体重较轻者，可预先用维生素A处理大鼠，确保肝星状细胞具有一定的浮力，在密度梯度离心时较好地与其它细胞分离。(2)应掌握好合适的灌注压，充分的灌流使肝组织内的血细胞、肝内免疫活性细胞以及其它杂质冲冼得较为干净，减少了上述杂质的存在对肝星状细胞的纯度、活率及体外培养所产生的不良影响。(3)肝脏原位酶消化是否适度，是影响细胞得率及活力的关键因素。如消化不充分，肝细胞大量存在，则会影响星状细胞的纯度。因此，须保证门静脉插管良好，消化酶通过门脉系统均匀地作用于肝组织，可提高酶的使用率。(4)在前灌流液中加入一定量的小牛血清有利于提高分离后的肝星状细胞活率，在预试验中也证实了这一点，其原因可能是小牛血清为离体肝星状细胞提供了代谢需要并且维持了细胞外环境的胶体渗透压。(5)Nycodenz密度梯度离心分离HSCs时，尽可能少吸取细胞层界下液体，否则会夹杂Kupffer细胞，影响星状细胞的纯度。
除以上各点外，尚有许多因素均可影响肝星状细胞的分离效果，如肝星状细胞分离过程的无菌程度、门静脉—下腔静脉插管是否顺当、肝脏本身的质量、离心洗涤的速度以及环境温度等，这些都应予以注意。
新分离的星状细胞由于富含维生素A脂滴，在327nm波长光激发下，呈蓝绿色荧光。但该荧光极易猝灭，操作过程中光暴露等均可影响其荧光性。另外，随着培养时间的延长，星状细胞的这种含脂滴的荧光特性会逐渐消失。肝星状细胞具有肌细胞的特征，Desmin是平滑肌细胞内特有的一种中间丝，HSCs具有肌成纤维细胞的某些特征，因而胞浆中含有中间丝蛋白Desmin[6] ，该蛋白稳定地存在于原代及传代的星状细胞中，静止和活化的HSCs均合成Desmin。Desmin免疫组化是鉴定肝星状细胞的可靠指标[7] 。本试验分离的肝星状细胞经抗Desmin抗体免疫组化鉴定，细胞纯度达90%。HSCs的鉴定往往需要几方面的综合指标检测。
总之，我们摸索出的这一套肝星状细胞分离培养及鉴定方法，经多次实验证实，在保证HSCs纯度的同时，提高了产量和活率，为进一步研究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。
[参考文献]
[1]AHERN M，HALL P，HALLIDAY J，et al.Hepatic stellate cell nomenclature[J].Hepatology，1996，23(1):193.
[2]KNOOK D L，SEFFELAAR A M，DELLEUW A M.Fat-storing cells of the rat liver:their isolation and purification[J].Exp Cell Res，1982，139(2):468.471.
[3]WU J，ZERN M A.Hepatic stellate cells:a target for the treat-ment of liver fibrosis[J].J Gastroenterol，2000，35(9):665.672.
[4]OKAZAKI I，WATANABE T，HOZAWA S，et al.Molecular mechanism of the reversibility of hepatic fibrosis:with special refer-ence to the role of matrix metalloproteinases[J].J Gastroenterol Hepatol，2000，15(Suppl):D26.32.
[5]FRIEDMAN S L，ROLL F J.Isolation and culture of hepatic lipo-cytes，Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells by densidy gra-dient centrifugation with stractan[J].Anal Biochem，1987，161(1):207.218.
[6]NEUBAUER K，KNITTEL T，AURISCH S，et al.Glial fibrillary acidic protein-a cell type specific marker protein for Ito cells in vivo and in vitro[J].J Hepatol，1996，24(6):719.730.
[7]TSUTSUMI M，TAKADA A，TAKASE，S.Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells[J].Hepatology，1987，7(2):277.284.
[作者简介] 吴婷(1975-)，女，河北秦皇岛人，住院医师，医学硕士。
(南京医科大学附属脑科医院放射科，江苏南京 210029;东南大学附属中大医院放射科，江苏南京 210009)
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