肺炎支原体种特异性单克隆抗体杂交瘤制备及鉴定
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[摘要]目的 制备抗肺炎支原体种特异性单克隆抗体。 方法 以纯化的肺炎支原体膜蛋白抗原(相对分子质量为43×10 3 )加福氏免疫佐剂免疫8周龄雌性BALB.c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2.0.Ag14融合，以酶标记免疫吸附测定法(ELISA)筛选和鉴定所制备的单克隆抗体。 结果 共筛出3株分泌抗肺炎支原体种特异单克隆抗体杂交瘤，经免疫鉴定其分泌的免疫球蛋白类型为IgG1、IgG2a及IgM，与肺炎支原体有很强的亲和力，与种属相近的其它6株支原体没有交叉反应。 结论 本次筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌高浓度的肺炎支原体单克隆抗体，并且有很强的种特异性。
[关键词] 肺炎支原体;单克隆抗体;杂交瘤
Preparation and identification of monoclonal antibody specific for Mycoplasma pneumoniae
TU Shao-hua，YE Yuan-kang，SHEN Zhao-zai
(Lab of Tonji Hospital，Affiliated to Tonji University，Shanghai200065，China)
Abstract:Objective To prepare anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody.Methods 8-week fe-male BALB.c mouse was immunized by the purified membrane protein antigen with immunoadjuvant，its relative mo-lecular weight was43×10 3 .After，fusion between spleen cells from a mouse and SP2.0-Ag14mouse myeloma cells was done.Monoclonal antibodies were screened in indirect enzyme-labeled immunosorbent assay(ELISA).Results Three hybridomas producing monoclonal antibodies specific for Mycoplasma pneumoniae were obtained.The type of immunoglobulin which three hybridomas produced were identified for IgG1，IgG2a and IgM by immunology meth-od.None of the three monoclonal antibodies was implicated in immunological cross-reactivity with other isolates of Mycoplasma.Conclusion The three monoclonal antibodies were specific towards Mycoplasma pneumoniae.
Key words:Mycoplasma pneumoniae;monoclonal antibody;hybridomas
肺炎支原体是侵入人呼吸道的重要病原体，其感染广泛存在于世界各地。它能引起咽炎、支气管炎，尤以婴幼儿肺炎常见，有时也可引起其他系统的并发症，如脑膜炎、心肌炎、心包炎、肾炎和免疫性溶血性贫血等疾病。目前虽然国外已采用单克隆抗体酶标记免疫吸附测定法(ELISA)和金标来作病原学诊断，但国内病原学诊断仍主要采用分离培养和常规血清学试验，这些方法花费时间长，灵敏度不够高。研制国产抗人肺炎支原体种特异性单克隆抗体，将有助于对肺炎支原体感染进行早期快速诊断，对指导临床和合理用药有重要意义。
1 材料与方法
1.1 菌株与抗原
人肺炎支原体国际标准菌株购于首都儿科研究所。增菌培养后按文献[1]用非离子去污剂X.114抽提并纯化肺炎支原体膜蛋白抗原(相对分子质量为43×10 3 )。
1.2 免疫
8周龄雌性BALB.c小鼠3只，其中2只用纯化的肺炎支原体抗原(相对分子质量为43×10 3 )行腹腔(50μg)和尾静脉(40μg)注射，1只以同剂量抗原混于等体积的完全福氏佐剂腹腔和尾静脉注射。第14天加强免疫，除尾静脉剂量减至10μg外，其余与首次免疫方案相同。第17天以ELISA法测定小鼠尾静脉血血清抗体滴度。
1.3 杂交瘤融合
取免疫反应最好的1只小鼠在第24天按文献[2]方法加完全福氏佐剂免疫小鼠的脾细胞进行融合。BALB.c骨髓瘤细胞株SP2.0Ag14生长于含PGOP(青霉素、谷氨酰胺、草酰乙酸及丙酮酸)、20%胎牛血清的RPMI1640培养液内。融合前用8.偶氮鸟嘌呤(8.azoguanine)再选择一次，SP2.0Ag14细胞与脾细胞融合比例为10∶1，融合剂是含5%二甲基亚砜的聚乙二醇1000，融合后的细胞悬浮于含PGOP混合物的HAT.20%胎牛血清RPMI1640培养液中，用局限性稀释法进行细胞的克隆。
1.4 ELISA法检测抗体
按Hirschberg等[3] 的ELISA法进行杂交瘤上清液肺炎支原体抗体的检测。即纯化抗原包被(0.2μg·孔 -1 )聚丙乙稀微量反应板，同样浓度包被6种相近支原体抗原(溶脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体抗原)。结合物是辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白(以色列Miles-yeda公司)，底物溶液是TMB.过氧化氢尿素溶液。
1.5 单克隆抗体亚类鉴定
使用美国MILES公司的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM免疫血清与原体积1.20的杂交瘤细胞培养上清液作免疫学鉴定，确定杂交瘤分泌抗体的免疫球蛋白型及亚型。
1.6 腹水单克隆抗体制备
注射前1～2周，以0.5ml降植烷(pristane)腹腔注射8周龄雌性BALB.c小鼠，然后以约10 6 杂交瘤细胞作腹腔注射。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立
骨髓瘤SP2.0Ag14细胞与脾细胞融合后种植1152 微孔内(96孔板×12块)，12d后约70%微孔生长出典型克隆，ELISA法测定全部1152微孔上清液肺炎支原体抗体，其中33孔强阳性，每阳性孔克隆数量介于1～5。将克隆移至一新的前一天种植巨噬细胞的96孔板内，每个克隆占据1孔，共计68孔。待孔内杂交瘤细胞生长至1.3～1.2孔面积时，再次测定上清液肺炎支原体抗体，其中14孔阳性。局限性稀释2～3次后，ELISA检测该14株杂交瘤上清液肺炎支原体抗体，结果其中3株(5B9、4D6、5F8)上清液阳性、5株弱阳性，余均阴性。这3株阳性杂交瘤的染色体平均数为98条，能稳定传代，抗体滴度未见改变，被选为建株杂交瘤。
2.2 单克隆抗体的滴度及亚类鉴定
对3株杂交瘤培养上清液抗体进行鉴定，结果5B9株分泌的抗体为IgG1，4D6株为IgG2a，5F8株为IgM，其相应小鼠的腹水中单克隆抗体IgG滴度>1∶25600，IgM滴度在1∶3200～1∶6400之间。
2.3 单克隆抗体的特异性试验
采用本次试验获得的3个抗人肺炎支原体单克隆抗体，以及本室制备的支原体多克隆抗体，以间接ELISA与种属相近的6种不同支原体进行凝集试验，证明其特异性好，有明显种特异性，见表1。
表1 抗肺炎支原体单克隆抗体的特异性试验结果(略)
注:单克隆抗体稀释度a=1∶200，b=1∶400
3 讨论
由于支原体多克隆血清在种属相近的支原体间存在相当程度的免疫交叉反应，使得用多克隆抗体进行肺炎支原体抗原分析无法得到满意的结果[4] 。近年来国外已应用肺炎支原体单克隆抗体以ELISA和金标的方法检测肺炎支原体抗原，对肺炎支原体的早期诊断有重要意义。由于尚无国产肺炎支原体单克隆抗体，一般都采用分离培养的方法检测和鉴定肺炎支原体。此方法虽特异性强，但时间过长(10～15d)，且灵敏度不高，对临床诊断与治疗帮助不大。另一方面常规血清学检查主要是检测多克隆抗体，此方法虽然简便快速，但特异性不高，容易有交叉反应，且达不到早期诊断的目的。所以研制国产化种特异性肺炎支原体单克隆抗体可以提高诊断的灵敏度和特异度，能达到早期诊断的目的，具有重要的临床意义。
制备特异性强的单克隆抗体，抗原的选择是关键。肺炎支原体的抗原成分有糖脂和蛋白质，糖脂抗原具有非专一性，制备的单克隆抗体特异性差;膜抗原的特异性较好。本次试验选择43kDa膜蛋白抗原免疫动物制备的单克隆抗体具有很强的特异性，特别是和生殖支原体没有交叉反应，解决了肺炎支原体P1蛋白和膜结合蛋白制备的单克隆抗体与生殖支原体存在交叉反应的问题，和文献报道[1，5] 一致。
本次试验已证明制备的抗肺炎支原体43kDa膜蛋白抗原的单克隆抗体对主要常见支原体溶脲脲原体、人型支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体及生殖支原体均无交叉反应，故特异性很强。但如何将已筛选到的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株保存、传代、繁殖，并提高其分泌能力，如何将其分泌的特异性很强的抗体制备成国产试剂盒用于临床和科研，将是后续研究内容。
[参考文献]
[1]CIMOLAI N，BRYAN L E.TO M.Immunological cross-reactivity of a Mycoplasma.Pneumoniae membrane-associated protein antigen with Mycoplasma genitalium and Acholeplasma laidlawii[J].J Clin Microbiol，1987，25(11):2136.2139.
[2]GEARY S J，RYAN J A，FORSYTH M H，et al.Development of monoclonal antibodies for the detection of Mycoplasma pneumoniae [J].Mol Cell Probes，1993，7(2):133.138.
[3]HIRSCHBERG L，HOLME T.ELISA for detection of Mycoplasma pneumoniae antigens using monoclonal antibodies[J].APMIS，1991，99(5):475.481.
[4]CIMOLAI N，SCHRYVERS A，BRYAN L E，et al.Culture-ampli-fied immunological detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens[J].Diagn Microbiol Infect Dis，1988，9(4):207.212.
[5]CIMOLAI N.Mycoplasma pneumoniae lacks immunologically-active eukaryotic actin-like antigens[J].Scand J Infect Dis，1994，26(3): 358.360.
[基金项目] 上海市卫生局资助项目[S99(14)]。
[作者简介] 涂少华(1967-)，男，江西九江人，主管技师。
(同济大学附属同济医院检验科，上海 200065)
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