FasR和FasL基因在口腔癌组织中表达与凋亡关系研究
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参见附件(227KB，3页)。
[摘要]目的 探讨口腔癌组织及正常组织的凋亡与FasR、FasL基因表达的关系。 方法 利用免疫组织化学法检测口腔癌组织及癌旁正常组织中FasR、FasL基因的表达，采用原位末端标记(TUNEL)法检测口腔癌组织标本中的凋亡情况。 结果 FasR基因在口腔癌组织和正常口腔组织中的阳性表达率分别为56.7%(38.67)和83.6%(38.42)，FasR基因在口腔癌组织中的阳性表达率显著低于正常口腔组织(P<0.001)。FasL基因在口腔癌组织和正常口腔组织中的阳性表达率分别为85.7%(56.67)和16.7%(7.42)，口腔癌组织中FasL基因的表达显著高于正常口腔组织(P<0.001)。口腔癌组织细胞凋亡指数显著低于正常口腔组织(P<0.001)。FasR阳性的口腔癌组织细胞凋亡指数显著高于FasR阴性者(P<0.001)，而FasL阳性的口腔癌组织细胞凋亡指数显著低于FasL阴性者(P<0.05)。 结论 FasR和FasL基因在口腔癌组织细胞凋亡过程中存在着协同或拮抗作用的关系。
[关键词] 口腔癌;凋亡;FasR基因;FasL基因
Study on the relationship between the expressions of FasR and
FasL genes and apoptosis in oral carcinoma
TIAN Qing-zhong，HAN Xi-lin，SUN Xin-chen
(1.Department of Oncology，Xuzhou General Hospital，Southeast University，Xuzhou221009，China;2.Xuzhou Tumor Institute，Southeast University，Xuzhou221009，China)
Abstract:Objective To investigate the inter-relationship between the expressions of FasR and FasL genes and spontaneous apoptosis in oral carcinoma.Methods Oral carcinoma and oral tissue were examined for the ex-pressions of FasR and FasL genes by immunohitochemistry，apoptosis by in-situ TUNEL.Results The detection rates of FasR in oral carcinoma and oral tissue were56.7%(38/67)and83.6%(38/42)respectively，expression of FasR in oral carcinoma was significantly lower than that in oral tissue(P<0.001).The delection rates of FasL in oral carcinoma and oral tissue were85.7%(56/67)and16.7%(7/42)reapectively，expression of FasL in oral carcinoma was significantly higher than that in oral tissue(P<0.001).The apoptotic index of cells in oral carcino-ma was significantly lower than that in oral tissue(P<0.001).The apoptotic index of cells of FasR positive oral carcinoma was significantly higher than that of FasR negative(P<0.001).The apoptotic index of cells of FasL poi-tive oral carcinoma was significantly lower than that of FasL negative(P<0.05).Conclusion Expressions of FasR and FasL gene has synergistic or antagonistic action in apoptosis of oral carcinoma.
Key words:oral carcinoma;apoptosis;FasR gene;FasL gene
细胞凋亡及其调控是医学研究的热点，细胞凋亡失控为肿瘤发生的一个重要原因。为探讨FasR、FasL基因在口腔癌发生发展中的作用，作者对其在口腔癌及癌旁组织中的表达进行了检测，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集本院1996～2000年收治的67例口腔癌患者的手术病理标本，其中42例标本具有癌旁正常组织。67例标本中舌癌49例，口底癌10例，颊黏膜癌6例，齿龈癌1例，硬腭癌1例;男43例，女24例;年龄29～73岁，平均56岁;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者数分别为10、17、32及8例;淋巴结转移31例，占46.27%;鳞状细胞癌59例，腺癌5例，其他3例，所有标本均经病理检查再次证实。
1.2 检测试剂与方法
免疫组织化学(免疫组化)分析采用SPTM 法。其中SP TM 试剂盒为美国Vector生物试剂公司产品，DAB试剂盒为瑞士Flika生化试剂公司产品，FasR pAb和FasL pAb为美国Santa生物技术公司产品。标本均在同一条件下进行免疫组化染色，一抗稀释度为1∶50。各步骤间用PBS洗片，用PBS代替一抗性阴性对照。FasR用淋巴瘤的切片作阳性对照，FasL以睾丸组织切片作阳性对照。
细胞凋亡的检测采用原位末端标记(TUNEL)法。试剂盒为美国Vector生物试剂公司产品。所有标本均在同一条件下进行染色，操作步骤参照试剂盒说明书。阳性对照用DNAseⅠ消化的标本，诱使标本产生DNA断端;阴性对照用无TDT酶缓冲液代替。
1.3 结果判定方法
免疫组化结果判定:阳性为深黄色染色，FasR及FasL基因的蛋白产物位于细胞膜。每个标本于光镜下(×40)随机选择3个视野，每野计数肿瘤细胞及其中的阳性细胞，一般每野500个肿瘤细胞。每一标本均经两人观察，结果相近方可。阳性细胞<5%判定为“-”，≥5%而<25%判定为“+”，≥25%而<50%判定为“++”，≥50%判断为“+++”。
凋亡判定:细胞核有金黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每个标本于光镜下(×40)随机选择3个视野，计数肿瘤细胞及其中的阳性细胞，一般每野500个肿瘤细胞。每一标本均经两人观察，结果相近方可，并计算凋亡指数(凋亡细胞占肿瘤细胞的百分比)。
1.4 统计学方法
实验数据用SPSS软件包，应用t检验、卡方检验及卡方趋势检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 免疫组化检测FasR、FasL基因的表达
FasR基因在口腔癌组织中阳性表达38例，占56.7%;其中+、++、+++的例数分别为32、5、1例。在正常口腔组织中阳性表达36例，占85.7%;其中+、++、+++例数分别为22、12、2例。阳性表达口腔癌组织中FasR的表达率显著低于正常口腔组织(P<0.001)。
FasL基因在口腔癌组织中阳性表达56例，占83.6%;其中+、++、+++的例数分别为33、21、2例。在正常口腔组织中阳性表达7例，占16.7%;其中+、++、+++例数分别为5、2、0例，口腔癌组织中FasL的表达率显著高于正常口腔组织(P<0.001)。
2.2 FasR表达强度与病理类型、病期间的关系
FasR表达强度与肿瘤病理类型无关(P>0.05);虽然经χ2 趋势检验FasR表达强度与肿瘤分期无关(P>0.05)，随着肿瘤分期的增加，FasR具有表达率逐渐降低且表达强度逐渐减弱的趋势，见表1、2。表1 FasR表达在口腔癌病理类型之间的分布情况(略)表2 FasR表达在口腔癌病期之间的分布情况(略)
2.3 TUNEL法检测组织细胞凋亡
口腔癌组织细胞凋亡指数为0.2933±0.219，正常口腔组织为0.5108±0.263，口腔癌组织细胞的凋亡数显著低于正常口腔组织(P<0.001)。FasR阳性的口 腔癌组织细胞凋亡指数显著高于FasR阳性者(P<0.001)，而FasL阳性的口腔癌组织细胞凋亡指数显著低于FasL阴性者(P<0.05)，见表3。表3 FasR和FasL基因的表达与口腔癌组织细胞凋亡的关系(略)
3 讨 论
FasR是一种相对分子质量为45×103 的跨膜糖蛋白，与特异性抗体或配体结合触发Fas信号途径，导致多种细胞的凋亡，在维持机体的内环境稳定中具有重要作用[1] 。人类恶性肿瘤细胞对FasAb.FasL触发凋亡信号的敏感性主要依赖于细胞表面FasR的表达水平[2] 。因而，研究细胞表面FasR的表达对研究肿瘤发生、发展及机体对肿瘤的抵抗能力具有重要意义。本组检测结果说明FasR在口腔癌组织中阳性表达率明显低于正常口腔组织，随肿瘤临床分期增加FasR表达具有逐渐降低且表达强度减弱的趋势。口腔组织因其特殊的解剖生理给口腔癌的手术带来了许多困难，使部分肿瘤手术难以切除干净;另外，放疗残存及复发的口腔肿瘤的治疗，目前仍是困扰临床工作者的难题之一。本组结果显示FasR高表达于口腔癌组织，故今后在临床上研究局部注射Fas抗体.配体治疗手术难以切除干净口腔肿瘤、虽经放化疗仍有残存或短期内复发的口腔肿瘤是非常有意义的。
FasL是一种相对分子质量为40×103 的跨膜糖蛋白，高表达于免疫活性细胞。近来文献报道一些恶性肿瘤细胞也表达FasL[3] 。本组结果显示，FasL基因在口腔癌组织阳性表达率明显高于正常口腔组织。行使免疫监视与清除机制的免疫活性细胞多数高表达FasR，局部肿瘤组织表达FasL可以诱导免疫活性细胞的凋亡作用，且肿瘤细胞常常低表达FasR或表达突变的FasR，故其对免疫活性细胞的杀伤作用比对其亲本细胞更敏感[4] 。FasL的这些作用抑制机体的正常免疫监视与免疫清除机制，进一步促进了肿瘤的形成与进展，并可能参与恶性肿瘤的转移与种植过程[3] 。
值得注意的是，本研究中FasR、FasL基因在口腔癌组织中阳性表达率很高，但作者并没有检测到癌细胞有广泛凋亡的趋势，对此作者推测有两种可能:一是细胞表达有功能的FasR，并且其表达量达到一定强度是通过FasR基因诱导凋亡作用的首要条件[5] ，我们检测的结果显示FasR在口腔癌细胞表达的程度较低，所以对FasL诱导的凋亡作用不敏感;其次，肿瘤细胞中抗凋亡基因的表达产物，拮抗了FasR基因介导的凋亡信号传导 [6] ，造成细胞难以凋亡。因此研究如何调控FasR的表达及达到何种水平FasR对FasL诱导的凋亡作用敏感，是今后研究的重点。
[参考文献]
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[作者简介] 田庆中(1963-)，男，江苏徐州人，副主任医师。
(1.徐州市中心医院肿瘤外科，江苏徐州 221009; 2.东南大学肿瘤研究所，江苏徐州 221009)
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