自体骨髓干细胞动员治疗心肌梗死
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参见附件(242KB，3页)。
[摘要]目的 探讨基因重组人粒细胞集落刺激因子(rhG.CSF)动员骨髓干细胞对急性心肌梗死动物模型的治疗作用。 方法 将60只SD大鼠随机分成对照组和治疗组，结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心肌梗死实验模型。治疗组在复制大鼠心肌梗死模型3h后用经生理盐水稀释的rhG.CSF(2mg·L-1 )皮下注射10μg·kg-1 ·d-1 ，共5d;对照组复制大鼠心肌梗死模型3h后皮下注射等量生理盐水，共5d。在复制大鼠心肌梗死模型24、48h和2周后，两组分别先后各取10只大鼠行在体心功能(±dp.dt max )测定，测定完毕后各组随机选取6只大鼠处死行心脏梗死范围的测量，其余大鼠处死取出心脏行HE染色及CD34+ 免疫组织化学分析。 结果 结扎冠状动脉左前降支24、48h和2周后治疗组±dp.dtmax 均高于对照组(P<0.01);治疗组心脏梗死范围低于对照组(P<0.01)。病理检查显示对照组心肌梗死区周围有较多以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，而治疗组大鼠心肌坏死程度较对照组轻，浸润的细胞以CD34+ 的单个核细胞为主，并可见新生的心肌细胞生长。 结论 rhG.CSF动员自体骨髓干细胞原位移植可修复梗死心肌、减少梗死范围、提高心功能，可用于急性心肌梗死的治疗。
[关键词] 心肌梗死;骨髓干细胞;移植;粒细胞集落刺激因子;大鼠
Repair of infarcted myocardium by intramyocardial transplantation
of mobilized autologous bone marrow stem cells
MAO Wen-kai，LIU Zhi-yong
(1.Department of Cardiac Surgery，Qinghai Cardiovascular Hospital，Xining810012，China;2.Department of Cardiothoracic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor(rhG.CSF)mobilized bone marrow stem cells on treatment of acute myocardial infarction in rats.Methods Sixty rats were randomly divided into control group and treatment group.Under sterilization，rats model were made by opening chest and ligating the left anterior descending(LAD)coronary artery.Three hours after LAD ligation，the rates of treatment group were treated with rhG.CSF(10μg·kg-1 ·d-1 )for5days and those of control group were re-ceived saline.Heart fuction(±dp.dt max )was quantified from24hours to2weeks after LAD ligation，then hearts were harvested for histopathological examination and infarcted zone were quantified.Immunohistochemistry and HE stain were used to detect infiltration of CD34 + monocytes and the regeneration of myocytes in the infarction zone.Results The value of±dp.dt max of treatment group were higher than that of control group(P<0.01).Compared with control group，treatment group had smaller infarcted zone(P<0.01)after2weeks of LAD ligation.Large num-ber of infiltrative monocytes and some regenerative myocytes with positive expression of CD34+ were found in the in-farct zones of the treatment group，while majority of the infiltrative inflammatory cells in control group were neutro-phils and + .Conclusions In situ transplantation of autologous bone marrow stem cells mobilized by G.CSF can repair the infarcted myocardium，re-duce infarction size and improve cardiac founction.
Key words:myocardial infarction;bone marrow stem cells;transplantation;granulocyte colony stimulating fac-tor;rats
成人心脏缺乏确定的前体细胞或干细胞，心肌在损伤发生后不能再生，只能由成纤维细胞填充，最终为瘢痕组织替代，并逐步发生心室重构，形成慢性心力衰竭。干细胞移植可以取代受损心肌细胞，达到治疗心肌梗死的目的。且由于自体同源性及来源充足易于获取，使自体骨髓干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)成为最佳种子细胞。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G.CSF)是骨髓干细胞强有力的动员剂，它可以使外周血中干细胞较正常增高数十倍。本研究拟用G.CSF动员急性心肌梗死动物模型自体骨髓干细胞，观察其向心肌梗死部位的迁移情况及对心肌梗死范围和心功能的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物
SD大鼠60只，雌雄不拘，体重200～300g，由东南大学医学院实验动物中心提供。
1.2 药品及试剂
基因重组人粒细胞集落刺激因子(rhG.CSF)购自东南大学附属中大医院药房。兔抗大鼠CD34+ IgG型单克隆抗体和即用型SABC试剂盒为博士德生物工程有限公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠心肌梗死实验模型的建立
大鼠用戊巴比妥10mg·kg-1 、阿托品1mg·kg-1 、氯胺酮75mg·kg-1 、利多卡因10mg·kg-1 复合腹腔麻醉，在大鼠第3、4气管软骨环间行气管切开插管，连接小动物呼吸机，潮气量3ml·(100g)-1 ，频率为60次·min-1 。左侧胸骨旁斜行切口，第3、4肋间进胸。以左冠状静脉为标志，7.0眼科无创缝合针穿过左冠状动脉前降支深部，进针深度为0.3～0.5mm，打结。见结扎区变紫30min后即为结扎成功。仔细观察无出血后关胸，待大鼠出现吞咽动作后，拔除气管插管。术毕肌肉注射青霉素4万U预防感染。
1.3.2 动物分组与处理
大鼠随机分为治疗组和对照组，每组30只。两组均结扎左冠状动脉前降支复制大鼠心肌梗死模型。术毕3h后，治疗组用经生理盐水稀释的基因重组人粒细胞集落刺激因子(2mg·L-1 )皮下注射(10μg·kg-1 ·d-1 )共5d，对照组皮下注射等 量生理盐水5d。
1.3.3 大鼠在体心功能测定
在复制大鼠心肌梗死模型后24、48h和2周后各组分别先后取大鼠10只，用MacLab.4s ADInstruments生物信号采集系统记录左室内压上升及下降最大速率(±dp/dtmax )，以+dp/dtmax 作为收缩性能的指标，以-dp.dtmax 作为舒张性能的指标。上述指标均为5个记录波形的平均值。
1.3.4 大鼠心脏梗死范围的测量
在体心功能测定完毕后各组随机选取6只大鼠处死，开胸取出心脏，生理盐水冲洗，修剪后自心尖向心底平行房室沟方向将左室切成厚度相近的6片。将切片放人38℃的1%氯化硝基四氮唑(triphenyi tertrazolium chloride，TTC)溶液(TTC溶于pH7.8的Na2 HPO4 /NaH2 PO4 缓冲液)中，染色20min后取出。此时在切面上可清晰地看到红色的未梗死区和灰白色的梗死区，然后在解剖显微镜下分离红色的未梗死区和灰白色的梗死区，分别称重，以梗死区心肌重量占危险区心肌重量(红色、灰白色心肌重量之和)的百分比作为衡量梗死范围的指标。
1.3.5 心肌组织HE染色
将各组剩余大鼠处死，取出心脏，在左心室游离壁正中沿心脏长轴切成两半，以10%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋。每隔100μm切取3μm厚的全心脏长轴面切片1张，共4张，分别做HE染色和免疫组织化学检测CD34+ 阳性细胞，光镜观察病理变化。
1.3.6 免疫组织化学染色
采用SABC法，按试剂盒说明书进行操作。两组均设阴性对照，以0.01mol·L-1 PBS代替兔抗大鼠CD34+ 单克隆抗体，检测CD34+ 阳性细胞。
1.4 统计学处理
各项指标以ˉx±s表示，采用SAS软件进行t检验，以P<0.05为结果有显著差异性。
2 结 果
2.1 实验过程中各组动物死亡情况
治疗组于建立模型时麻醉意外死亡2只，结扎左冠状动脉前降支时心率失常死亡5只。于模型建立后4、7、10天由于心衰各死亡1只。对照组于建立模型时麻醉意外死亡1只，结扎左冠状动脉前降支时心率失常死亡7只。于模型建立后第3、5、9、11天由于心衰各死亡1只。
2.2 两组在体心功能测定情况
见表1。表1 两组在体心功能测定(略)
2.3 两组心肌梗死范围的比较见表2。表2 两组左室重量、梗死重量、梗死范围结果(略)
2.4 病理学改变
结扎左冠状动脉前降支后24h，治疗组大鼠心肌坏死程度较对照组轻，心肌梗死灶中有大量单个核细胞浸润，并有与浸润的单个核细胞胞核形状相似、胞核较大而圆、位于细胞中央且胞浆少而深染的心肌细胞生长，两者的免疫组化检测均呈CD34+ 阳性。对照组心肌梗死灶浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主，无CD34+ 阳性浸润与CD34+ 阳性心肌细胞生长。结扎左冠状动脉前降支后2周，对照组可见较大量心肌瘢痕组织，主要分布于左室;治疗组心肌瘢痕组织较少。
3 讨 论
目前治疗心肌梗死的手段(药物、冠状动脉旁路移植术、经皮冠状动脉腔内成形术等)虽然可降低近期死亡率，却不能逆转已坏死的心肌，导致心力衰竭远期死亡率未见明显降低。有研究[1] 发现，心肌梗死后骨髓干细胞能自行迁移到心肌损伤部位，并横向分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，参与坏死心肌 组织再生，改善心功能。
然而，一般情况下进入到外周血循环中并迁移到心梗区域的骨髓干细胞数量极少，对坏死心肌组织的修复作用极为有限。因此，采用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血，增加外周血干细胞数量则有可能促进心肌组织的修复[2，3] 。骨髓内干细胞成分复杂，目前己证实 [4] ，G.CSF具有同时动员造血干细胞(包括CD34+ 和CD34- 细胞)、间质干细胞和成血管细胞的能力。因此，骨髓动员后，骨髓的多种干细胞均可能参与心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞再生，全面修复损伤心肌，实现心肌在结构和功能上的整合。
骨髓干细胞特异归巢于缺血心肌的详细机制尚不清楚。目前认为，骨髓干细胞的归巢是由粘附分子和趋化分子介导的，该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与。目前己知免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族、CD44四大类粘附分子均参与了该过程。心肌梗死后缺血区存在炎症反应，各种炎症介质的释放，粒、单核细胞浸润，肥大细胞激活，胞外基质蛋白的降解以及内皮细胞和心肌细胞粘附分子的表达，被认为是骨髓干细胞归巢的必要条件[5] 。
由于目前还不能从形态上识别骨髓来源的干细胞，对其鉴定、分离纯化是通过其表面标志进行。其中，大多数研究将CD34+ 单个核细胞视为造血干细胞。本研究应用rhG.CSF动员急性心肌梗死大鼠的自体骨髓干细胞24h后，治疗组大鼠心肌坏死灶中可见大量单个核细胞浸润，免疫组织化学检测呈CD34+ 阳性，考虑为骨髓来源的干细胞(包括造血干细胞、内皮干细胞等);与此同时，还发现有与浸润的单个核细胞相似、但胞核较大而圆且位于细胞中央、胞浆少而深染的细胞生长，其免疫组化检测CD34+ 也呈阳性，推测可能是浸润的骨髓干细胞正处于向心肌细胞分化的早期，故形态较幼稚。因此，证明了心肌梗死发生后，在骨髓动员剂作用下，骨髓干细胞能向心肌梗死区域内迁移并存活，向心肌细胞分化。据此，本研究认为，动员自体骨髓干细胞迁移入缺血心肌中，骨髓干细胞将发生“环境依赖性分化”，分化成心肌细胞样细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞。
陈运贤等[6] 应用rhG.CSF动员自体骨髓干细胞对急性心肌梗死患者进行心肌梗死原位移植的治疗，发现干细胞原位移植疗法能减小心肌梗死的范围，改善心功能。自体移植方法简单，无创伤性，骨髓干细胞不必先在体外分离纯化并扩增，不需要外科手术开胸或介入治疗的专门设备。动员骨髓来源的干细胞到心梗区可以增加梗死区内有功能的心肌细胞数量及形成新生血管，从结构和功能上修复损伤心肌。因此，当急性心肌梗死发生时，结合冠状动脉旁路移植术或经皮冠状动脉腔内成形术等治疗手段，通过动员骨髓干细胞能够使心肌再生，可望降低急性心肌梗死患者的近、远期死亡率。
[参考文献]
[1]ORLIC D，KAJSTURA J，CHIMENTI S，et al.Bone marrow stem cells regenerate infracted myocardium[J].Pediatr Transnsplant，2003，7(3Suppl):86.88.
[2]MENASCHE P，HAGEGE A A，SCORSIN M，et al.Myoblast trans-plantation for heart failure[J].Lancet，2001，357:279.280.
[3]MEZEY E，CHANDROSS K J，HARTA G，et al.Turning blood into brain:cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow[J].Science，2000，290:1779.1782.
[4]STRAUER B E，KORNOWSKI R.Stem cell therapy in perspective
[J].Circulation，2003，107:929.934.
[5]ORLIC D，KAJSTURA J，CHIMENTI S，et al.Mobilized bone mar-row cells repair the infracted heart，improving function and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:10344.10349.
[6]陈运贤，欧瑞明，钟雪云.自体骨髓干细胞原位移植治疗急性心肌梗死的临床研究[J].中国病理生理杂志，2003，19:452.454.
(1.青海省心血管病医院心脏外科，青海西宁 810012;2.东南大学附属中大医院心胸外科，江苏南京 210009)
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