雌激素对低氧性肺动脉高压大鼠ＮＯ、ＮＯＳ的作用
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[摘要]目的 探讨在雌激素干预下，低氧性肺动脉高压大鼠血浆及肺组织匀浆一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性和结构型NOS(cNOS)活性的变化。 方法 采用间断常压低氧法建立大鼠低氧性肺动脉高压模型。将18只雄性SD大鼠随机分成:正常对照组、雌激素组(每天低氧前腹腔注射17.β雌二醇30μg·kg-1 ，共3周)、低氧组(每天低氧前腹腔注射生理盐水2ml，共3周)。以右心导管法测定平均肺动脉压(mPAP);测定右心室肥厚指数〔RV.(LV+S)〕;肺组织切片采用HE染色，经图像分析技术测定大鼠肺小血管管壁厚度指标〔管壁厚度占外径的百分比(WT%)和管壁面积占总面积的百分比(WA%)〕。采用硝酸还原法检测各组大鼠血浆及肺组织匀浆NO含量;用化学比色法检测各组大鼠肺组织匀浆NOS和cNOS活性。 结果 低氧组的大鼠mPAP、RV.(LV+S)、WT%和WA%均高于正常对照组(P<0.01);雌激素组的大鼠mPAP、RV.(LV+S)、WT%和WA%均低于低氧组(P<0.01)。HE染色切片显示正常对照组大鼠肺小血管管壁菲薄，低氧3周后，低氧组大鼠肺小血管普遍增厚，管腔狭窄。雌激素组的肺小血管管壁及血管管腔狭窄程度较低氧组显著减轻。低氧组大鼠的血浆及肺组织匀浆NO含量、NOS活性和cNOS活性均较正常对照组明显降低(P<0.05)。雌激素组血浆及肺组织匀浆中NO含量、NOS活性和cNOS均较低氧组明显增加(P<0.05)。 结论 17.β雌二醇对低氧性肺动脉高压血管重建的预防作用可能部分是通过上调肺组织NO含量和NOS活性实现的。
[关键词] 17.β雌二醇;低氧性肺动脉高压;肺血管重建;一氧化氮(NO);一氧化氮合酶(NOS)
The effect of estrogen on nitric oxide content and nitric oxide
synthase activity in hypoxic pulmonary hypertensive rats
SUN Si-qing，LIN Yong，ZHU Xiao.li，ZHANG Wei
(Department of Respiratory Medicine，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the effect of17-βestradiol on nitric oxide content and nitric oxide syn-thase activity in hypoxic pulmonary hypertensive rats.Methods The animal model of pulmonary hypertension was established by exposing the rats to normabaric hypoxic conditions for3weeks.Eighteen male SD rats were randomly divided into three groups:control group，E2 preventive group，hypoxic group.The mean pulmonary artery pressure(mPAP)was examined by right cardiac catheterization，and the right ventricle(RV)and left ventricle plus septum(LV+S)of rat were weighed respectively，and the RV.(LV+S)was calculated.Lung specimens were exam-ined by light microscope and morphological analysis semiquantitatively.The WT%(ratio of vascular wall thick-ness.vascular external diameter)and WA%(ratio of vascular wall area.total vascular area)were measured by a computerized image analyzer.NO and NOS activity in the plasma and lung tissue were measured via spectropho-tometer.Results In the hypoxic group，mPAP，the RV.(LV+S)，WT%and WA%increased significantly compared with those in the control group(all P<0.01).In the preventive group，the mPAP，the RV.(LV+S)，WT%and WA%decreased remarkably compared with those in hypoxic group(all P<0.01).In the hypoxic group，NO and NOS activity in the plasma and lung tissue were markedly decreased in comparison with control group(all P<0.05).In the E 2 preventive group，NO and NOS activity in the plasma and lung tissue were higher than those in the hypoxic group，respectively(all P<0.05).Conclusion It is suggested that17-βestradiol can partly reduce pulmonary arterial remodeling by increasing concentration of NO and NOS activity.
Key words:17-βestradiol;hypoxic pulmonary hypertension;pulmonary artery remodeling;nitric oxide(NO);nitric oxide synthase(NOS)
慢性低氧能导致肺动脉高压形成，其病理基础为肺小动脉结构重建，其发生机制尚不清楚。低氧性肺动脉高压大鼠一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性下降[1，2] 。在体外培养的肺血管内皮细胞中给予生理剂量的雌激素，可使内皮细胞基础NO释放量上升，NOS活性明显增加[3] 。本试验拟通过雌激素干预低氧性肺动脉高压的形成，观察大鼠血浆及肺组织匀浆NO含量、NOS活性和结构型NOS(cNOS)活性的变化，探讨雌激素在体对低氧性肺动脉高压的作用。
1 材料与方法
1.1 低氧性肺动脉高压动物模型复制采用间断性低氧法复制低氧性肺动脉高压动物模型[4] 。将大鼠置于有机玻璃舱内，舱内氧浓度由自动控制仪调控，使其维持在体积分数为(10±0.5)%，每天8h，每周6d，共3周。将18只雄性SD大鼠(由东南大学实验动物中心提供)随机分成:正常对照组、雌激素组(每天低氧前腹腔注射17.β雌二醇30μg·kg -1 ，共3周)、低氧组(每天低氧前腹腔注射生理盐水2ml，共3周)。正常对照组6只大鼠置于同一实验室内，呼吸室内空气。所有试验用的大鼠饲养条件均相同，自由饮水和摄食。
1.2 肺血流动力学测定[5] 和右心室肥厚的测定
大鼠用1%戊巴比妥钠(50mg·kg-1 ，腹腔注射)麻醉后，经右侧颈外静脉插入硅胶管至肺动脉。导管另一端接静脉压力换能器到MacLab.4s AD Instruments生物信号采集系统，经Chart v3.5.2生物信号分析系统记录并计算平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pres-sure，mPAP)。
测定压力后，剖胸取心脏置于10%的中性福尔马林液中固定1周后，分离出右心室游离壁(RV)及左心室(LV)加室间隔(S)，并称取其质量。用RV.(LV+S)的质量比作为右心室肥厚的指标。
1.3 血浆及肺组织匀浆NO含量测定
测压完成后，经左侧颈总动脉采集血样2ml，1500 r·min-1 ，离心10min，取血浆待测。将动物处死后立即取右肺叶，生理盐水清洗3次，滤纸吸干后称重，在玻璃匀浆器中制成10%肺组织匀浆，2500r·min-1 离心10min，取上清液低温保存待测。血浆及肺组织匀浆NO测定及NOS活性测定按试剂盒说明书(南京建成生物医学工程研究所)操作。
1.4 大鼠肺血管组织学检查
取大鼠左肺以10%中性甲醛溶液固定3d，沿肺门横断取材，石蜡包埋切片，进行常规HE染色，观察肺小动脉形态学变化。用SP.2000病理图文报告系统进行图像采集，IMAGE.PRO plus4.5软件进行图像分析，测定与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外径、管壁厚度、血管总面积及管壁面积，计算出管壁厚度占外径的百分比(WT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)，反映肺小动脉管壁增厚程度。
1.5 统计学处理数据均以ˉx±s表示，组间数据比较采用两组样本均数配对t检验。采用SPSS统计软件11.5进行统计分析。
2 结 果
2.1 大鼠mPAP和右心室肥厚指标的改变
结果见表1。低氧组的mPAP和右心室肥厚指标均显著高于正常对照组(P<0.01)。雌激素组的mPAP和右心室肥厚指标均显著低于低氧组(P<0.01)。
表1 各组大鼠mPAP、右心室肥厚指标的比较(略)
2.2 低氧大鼠肺血管形态学改变
正常对照组大鼠肺小血管管壁较薄，管腔较大。常压低氧3周后低氧组的大鼠肺小动脉普遍增厚，管腔狭窄。雌激素组的肺小动脉管壁及血管管腔狭窄程度显著减轻。
2.3 肺小动脉图像分析
大鼠WT%、WA%的改变见表2。常压低氧3周后低氧组的大鼠WT%、WA%均高于正常对照组，差异有显著性(P<0.01)。雌激素组WT%、WA%均显著低于低氧组，差异有显著性(P<0.01)。以上结果显示慢性低氧可导致肺血管壁增厚、管腔狭窄等血管重建病理改变，而雌激素对低氧性肺血管重建具有一定的预防作用。
表2 大鼠肺小动脉WT%、WA%的变化(略)
2.4 血浆及肺组织匀浆NO含量的变化
大鼠血浆及肺组织匀浆NO含量的变化见表3。常压低氧3周后大鼠血浆及肺组织匀浆NO、NOS和cNOS明显降低。雌激素组血浆及肺组织匀浆NO、NOS和cNOS明显增加。
表3 各组大鼠血浆及肺组织匀浆NO含量的变化(略)
3 讨 论
低氧性肺血管结构重建是低氧性肺动脉压力持续升高的主要原因。我们通过在体实验发现雌激素在一定程度上可预防低氧性肺动脉高压的形成，并且主要是通过减轻肺血管重建实现的;雌激素同时还可部分逆转低氧引起的右心室肥厚。已有的研究证实，雌激素可通过保护和调节肺血管内皮细胞功能、促进血管扩张及抑制平滑肌细胞增殖的作用，改善肺动脉高压中的血流动力学和气体交换，并可阻抑肺动脉高压中的肺血管重建[6，7] 。
我们发现慢性低氧大鼠血浆及肺组织匀浆NO含量、NOS活性和cNOS活性明显降低，提示低氧可使NOS活性降低，致NO的合成和释放减少;NO主要是通过扩张血管平滑肌细胞产生舒血管作用，同时可抑制血管平滑肌增生。慢性低氧所致的NO合成和释放减少可促进肺动脉高压的形成和肺血管结构的重建[8] 。本实验结果显示，预防性使用雌激素可以增加低氧情况下肺组织NOS的活性，促进NO的合成和释放。其他研究亦发现，雌二醇能增强大鼠肺血管内皮细胞cNOS活性和NO产量[9] ;在培养的肺血管内皮细胞中给予生理剂量的雌激素，导致内皮细胞基础NO释放量有一个快速的上升，内皮型NO合成酶(eNOS)活性明显增加[10] ;并且雌激素可通过受体介导途径上调 eNOS的基因表达，增加NOS的合成或使其活性增强，从而增加NO的合成和释放[11] ;可通过雌激素受体，诱导PI3K.Akt串联快速刺激eNOS激活[12] ;可通过增加肺血管内皮细胞膜受体介导Ca2+ 内流[13] ;可引起肺动脉内皮细胞内的eNOS快速激活，此快速反应不牵涉到基因转录，可能是通过MAP激酶机制介导[14] ;然而也有不同的看法，Resta认为雌激素干预低氧性肺血管重建的机制不是通过上调肺eNOS的表达或增加内皮源性的NO依赖性的反应[15] 。
本组研究发现，预防性使用雌激素可以降低低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉压力，减轻肺血管重构及右心室肥厚，其作用机制可能是通过上调肺组织NO含量和NOS活性实现的。
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(东南大学附属中大医院呼吸科，江苏南京 210009)
[基金项目] 铁道部科技基金资助项目(J2000Z086);东南大学科学基金(9247341170)。
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