半重叠ＰＣＲ检测急性淋巴细胞白血病微小残留病的临床意义
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[摘要]目的 用半重叠多聚酶链反应(PCR)检测免疫球蛋白重链(IgH)、T细胞受体γ链(TCRγ)克隆性基因重排，研究急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留白血病(MRD)的动态变化和消长规律，预测复发，判断预后。 方法 选择14例完全缓解(CR)的ALL患者，采集CR后不同时期骨髓标本，用半重叠PCR检测IgH、TCRγ克隆性基因重排。 结果 经过正规化疗的14例ALL患者在CR后不同时期，MRD水平不同;MRD的消长规律为波浪式7例，呈直线下降3例，持续阴性2例，复发2例中1例为MRD持续阳性、1例MRD由阴性转为阳性。 结论 一次MRD.PCR检测不足以说明体内残留白血病细胞水平，连续PCR检测及动态观察对于预测复发、判断预后、评价骨髓移植(BMT)效果、研究白血病化疗方案及停药时间更有临床价值。
[关键词] 多聚酶链反应;急性淋巴细胞白血病;微小残留病
微小残留白血病(MRD)是指白血病完全缓解后体内残留的白血病细胞，被认为是急性白血病缓解后复发的主要根源。以往有不少技术用于MRD的检测，但均存在敏感性差和特异性不强等缺陷，而PCR技术扩增免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体γ链(TCRγ)单克隆性基因重排用于检测急性淋巴细胞白血病(ALL).MRD敏感性高、特异性强，有助于更加深入地研究MRD的生物学特性，以预测复发，判断预后。
1 材料和方法
1.1 材料
选择经骨髓细胞学检查确诊，按细胞形态学分型(FAB分型)，均按期进行临床正规化疗的ALL完全缓解(CR)患者14例，年龄为18～35岁，平均(26.00±4.35)岁;其中男10例，女4例。分别于CR后不同时期开始留取骨髓标本，以后每间隔3个月留取1次骨髓标本，共4次，予以动态观察。以原发性血小板减少性紫癜1例、缺铁性贫血1例及再生障碍性贫血1例的骨髓标本作为对照组。取ALL.CR后不同时期的骨髓标本1m1，加3.8%枸缘酸钠防凝，立即送实验室处理。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
将骨髓标本用Ficoll液分离出淋巴细胞层，生理盐水洗2遍，2000r·min-1 离心10min，弃上清。按消化煮沸法[1] ，加消化液50μl(含100mmol·L-1 Tris.Hcl缓冲液，pH8.0，1000mmol·L-1 EDTA，1%SDS)，加蛋白酶K至终浓度200μg·ml-1 ，置55℃水浴3h，37℃温箱过液，煮沸20min，灭活蛋白酶K，5000r·min-1 离心5min，取上清做PCR的DNA模板，-20℃贮存。
1.2.2 PCR引物及产物
采用半重叠扩增引物。IgH基因引物序列参照文献[2]。V区引物为FR3 A(为共同引物)，J区引物有2种，分别为LJH(第一轮扩增引物)及VLJH(第二轮扩增引物)。所期望的扩增片段长度在100～l20bp之间。TCRγ基因引物用于扩增TCR基因重排V区和J区，引物序列参照文献[3]。在10条混合引物中优选出3条检出率最高的引物，组成TCRγ半重叠PCR引物，进行双轮扩增。Jγ为共同引物，VL.1为第一轮扩增引物，VS.1为第二轮扩增引物。所期望的扩增片段长度为100～130bp。
1.2.3 PCR方法
PCR反应体系为25μl，含模板DNA5μl，10×buffer2.5μl，10mmol·L-1 dNTP1.0μl，每种引物各1μl，Taq酶0.75U(晶美生物公司)，剩余部分用无菌高纯水补足，每管反应液表面覆盖等体积灭菌石蜡油，以防液体蒸发，将第一轮PCR扩增产物经1∶100稀释，取1μl作为第二轮扩增的模板DNA。PCR循环程序:用PTC.51B自动温度循环仪(军事医学科学院放射医学研究所研制)，每次扩增均经过95℃600s充分解链，88℃180s加酶，94℃60s、53℃60s、72℃60s3个变温期。第一轮扩增30个循环周期;第二轮扩增20个循环周期，以期增加敏感性并减少非特异性产物。扩增完毕于72℃充分延伸600s。每次PCR扩增均设置无DNA样品管作为阴性对照。扩增完毕后取10μ1PCR产物在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，110V2h。pBR322/HaeⅢDNA Markers或pGEM DNA Markers作为分子质量标记。EB染色后紫外灯下观察结果，照相。
2 结 果
阳性结果的判断:特异性阳性条带在所期望的碱基数量大小范围之内。IgH基因重排特异性阳性条带约10bp(图1)，TCRγ基因重排特异性阳性条带约124bp(图2)。半重叠PCR隐约可见2条带。14例ALL.CR后不同时期的MRD情况见表1。由表1可见，MRD呈波浪式消长规律者7例(50%)，MRD水平呈直线下降者3例，持续阴性者2例，由持续阳性而复发者1例，由阴性转为阳性而复发者1例。
表1 PCR检测14例ALL.CR后MRD结果(略)
3 讨 论
目前普遍认为，在各种白血病的治疗中，MRD是导致复发的主要根源。白血病治愈的关键是彻底根除MRD。在白血病治疗达到CR期时，体内残留的白血病细胞虽达108 ～109 之多，但因临床上缺乏检测此类细胞的敏感方法，故难以客观地判断杀灭效果。IgH和TCR单克隆性基因重排是白血病细胞的重要标志。PCR方法检测IgH和TCRγ克隆性基因重排已被证明是一种高度敏感和特异的分析方法，能检测10-6 的恶性克隆细胞，尤其是半重叠PCR，敏感性极高，并具有简便、快速、特异性强及DNA用量少、对DNA模板质量要求低、无放射性污染等优点。
本研究用半重叠PCR检测IgH、TCRγ克隆性基因重排，研究ALL.MRD的动态变化和消长规律，为临床进一步预测复发，指导治疗，使白血病化疗方案个体化，为白血病的根治建立理论根据。由表1结果可见，14例经过正规化疗的ALL患者在CR后不同时期，MRD水平不同。其中7例MRD的消长规律为波浪式，最终可能达到恶性克隆细胞的消灭;3例经过几次巩固化疗，MRD水平呈直线下降，若经长期观察，MRD水平持续阴性，则预后较好;2例PCR持续阴性，若排除假阴性，则预后良好，说明体内恶性克隆近于消灭，可达完全治愈。2例复发者中1例为MRD持续阳性，另l例为MRD由阴性转为阳性而复发，说明体内持续存在残留白血病细胞或有增长趋势。由此可表明，若MRD检测持续阳性，则预后不良，复发的可能性大;若MRD由阴性转为阳性，则提示复发。此时如调整化疗方案，有可能控制复发。本研究表明，一次MRD.PCR检测不足以说明体内残留白血病细胞的水平，而连续PCR检测及动态观察对于预测复发、判断预后、评价骨髓移植(BMT)效果、研究白血病化疗方案和具体停药时间更有临床价值。
半重叠PCR两轮扩增虽较普通PCR单轮扩增敏感性高、特异性强，但仍存在假阴性问题。近年来有学者提出白血病克隆演化及寡克隆问题[4] ，可能是MRD. PCR检测中假阴性的原因之一。有研究表明，40%的B系ALL患者在初诊时存在2种以上IgH克隆性重排，即为白血病的寡克隆性(oligoclonality)。这种白血病的寡克隆性是由于白血病克隆演化，形成不同的亚克隆(subclones)。也就是说，IgH基因重排在病程中可以发生改变，初诊与复发时IgH克隆性重排可完全不同，新的克隆可代替初始克隆或与之并存[5] 。这可能是由于在病程的不同期“优势克隆”不同，新出现的克隆可能具有增殖优势，尤其是原发克隆消失后出现的新克隆。这一克隆演化现象提示，在设计引物时应尽可能避开易变的VH .D连接区序列以减少克隆演化而产生的假阴性结果[6] ，此时如联合使用2种以上不同标志(IgH、TCRγ、TCRδ等)进行MRD.PCR检测，亦可减少假阴性[5] ，此外TCR基因较稳定，可能是检测MRD较好的标志。
[参考文献]
[1]季卉，朱梅刚，赵彤，等.多聚酶链反应技术在NHL基因诊断中的应用研究[J].中华病理学杂志，1994，23:207.210.
[2]万景华，TRAINOR K J，BRISCO M J，等.应用多聚酶链反应(PCR)快速诊断克隆性B淋巴细胞增殖性疾患[J].中华肿瘤学杂志，1990，12:242.246.
[3]李甘地，LORENZEN J，HANSMANN ML，等.应用T细胞受体家族特异性引物的PCR方法对T细胞性淋巴瘤的研究[J].中华病理学杂志，1994，23:211.214.
[4]KITCHINGMAN G R.Immunoglobulin heavy chain gene VH -D junctional diversity at diagnosis in patients with acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，1993，81:775.782.
[5]POTTER M N，STEWARD C G，OAKHILL A.Clonal instability in early B-lineage acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，1992，80:1630.1631.
[6]WASSERMAN R，YAMADAM，ITO Y，et a1.VH gene rearngement events can modify the immunoglogulin heavy chain during progres-sion of B-lineage acute lymphoblastic1eukemia[J].Blood，1992，79:223.228.
(1.南京军区南京总医院医学专修科，江苏南京 210002;2.济南军区总医院，山东济南 250031)
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