大鼠局灶性脑缺血再灌注后TACEmRNA表达变化的研究
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参见附件(200KB，3页)。
[摘要]目的 研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间脑皮质半暗带和中心区肿瘤坏死因子转换酶(TACE)转录水平的表达规律。 方法 用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，切取缺血半暗带及中心区皮质组织，采用逆转录.聚合酶链反应(RT.PCR)测定TACE mRNA水平的变化。 结果 在脑皮层缺血半暗带及中心区脑组织，TACE mRNA表达变化有两个高峰，分别在脑缺血再灌注后3h、12～24h(P<0.01)，在脑缺血再灌注后72h表达低于正常对照组(P<0.05或P<0.01)，7、14d未检测到TACE mRNA水平，21d出现低水平表达。 结论 TACE mRNA过度表达可能对脑缺血再灌注后早期神经元死亡起促进作用。
[关键词] 脑缺血;肿瘤坏死因子转换酶;半暗带
Expression of tumor necrosis factor-αconverting enzyme mRNA after focal
cerebral ischemia and reperfusion in rats
XU Hai-qing，ZI Xiao-hong，GUO Ke，FAN Xue-jun，SONG Zhi
(1.Department of Neurology，Xiangya3th Hostipal，Central South University，Changsha410013，China;2.Department of Neurology，Zhangda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the expression of tumor necrosis factor-αconverting enzyme transcription level in rat′s focal cerebral ischemic penumbra and core of cortices at different ischemic time.Methods The mid-dle cerebral artery occlusion models were established by using the intraluminal suture occlusion method in Wistar rats.Brain samples were harvested from ischemic penumbra and core of cortices.The change of TACE mRNA was assessed by RT-PCR.Results Expression of TACE mRNA in the penumbra and core regions reached the peak at reperfusion3and12.24h(P<0.01)，rapidly decreased to the low level in72h following ischemic reperfusion(P<0.05or P<0.01)，and wasn't detected in7d and14d.It came back to the low level in21d.Conclusion The overexpression of TACE mRNA was notably induce neuronal death after focal cerebral ischemic-reperfusion.
Key words:cerebral ischemia;tumor necrosis factor-αconverting enzyme;penumbra
在脑缺血再灌注损伤多种病理机制中，炎症细胞因子介导炎症级联反应引起神经元死亡已得到证实。肿瘤坏死因子转换酶(TACE)为肿瘤坏死因子.α(TNF.α)转换酶，属解整合素金属蛋白酶家族，广泛分布于人体各组织器官，在细胞表面大量表达;它可降解TNF.
α、转化生长因子.β(TGF.β)、L.选择蛋白、TNF受体Ⅰ、TNF受体Ⅱ、白细胞介素.1受体.2(IL.1R2)等[1～3] 。研究发现，TACE主要通过水解跨膜型TNF.α产生具有生物活性的分泌型TNF.α而发挥作用。为了进一步探讨TACE在脑缺血再灌注脑损伤中的表达规律及作用，本研究用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型，切取缺血半暗带及中心区皮质组织，采用逆转录.聚合酶链反应(RT.PCR)测定TACE转录水平的变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
选用清洁级健康雄性Wistar大鼠96只，体重250～320g，鼠龄3～4个月(由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供)。随机分为以下各组，每组8只，包括正常对照组、假手术组、模型组[包括缺血3h组，缺血3h再灌注3、6、12、24、48、72h及7、14、21d组，用O3Rxh(d)表示]。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备 参照Longa法[4] ，运用改良线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。
1.2.2 四氮唑红(TTC)染色
每组随机选取2只大鼠，处死后迅速取脑，置于-20℃冰箱中冷冻20min，距额极3mm开始切片，每片厚2mm，放入2%TTC溶液中37℃水浴30min后，转入4%多聚甲醛中，6h后观察。正常脑组织呈红染，缺血组织呈苍白色。
1.2.3 RT.PCR测定TACE mRNA量
(1)按参考文献[5]设计TACE引物(合成于上海生工生物工程技术公司):上游引物(1445～1464)5′.GTT ACA ACT CAT GAA TTG GG.3′，下游引物(1799～1817)5′.GAC AAT TTT TAC AGC AAG G.3′，TACE PCR产物为373bp;β.actin为内参照:上游引物(400～419)5′.GTA GCC ATC CAG GCT GTG TT.3′，下游引物(1028～1047)5′.CAG TGA GGC CAG GAT AGA GC.3′，β.actin PCR产物为648bp。(2)动物断头取脑，置于-20℃冰箱15～20min，分别剥取右侧大脑距离嗅球尖端7～11mm、大脑矢状裂至外侧裂上1.3(半暗带区)和下2.3的皮质组织(中心区)，液氮中保存。(3)运用美国Gibco BRL公司试剂Trizol提取Total RNA，具体按说明书操作;产物-70℃保存。(4)逆转录合成cDNA:运用美国MBI公司M.MuLV逆转录酶，取总RNA3μl，具体按说明书操作。产物置-20℃保存备用。(5)PCR扩增反应:最适条件模板2μl，MgCl2 1.5μl，上、下游引物各0.5μl，Taq酶1U，反应体积25μl，94℃预变性4min，再94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸7min。(6)电泳后，将凝胶放于Eagle EyeⅡ图像处理系统中测量各产物的光密度，得出TACE相对值。
1.2.4 统计学处理
TACE mRNA的相对表达量以 TACE.β.actin计算，实验数据以ˉx±s表示。成组设计多样本均数的比较用one-way ANOVA检验，多样本均数与一组均数间的比较用LSD.t和Games.Howell检验。
2 结 果
2.1 动物神经功能缺损
所有模型组动物在麻醉清醒后均呈现局限性脑缺血表现:左前肢屈曲或提颈时左前肢向下、不能上抬，或向外侧转圈，或行走时向左侧倾倒。
2.2 TTC染色
正常组与假手术组大鼠脑组织均呈红色，无梗死组织;模型组可见右侧脑组织大小不一的苍白色梗死组织，以距离嗅球尖端7～11mm区明显，左侧脑组织均呈红色。该模型缺血区域稳定可靠。
2.3 TACE mRNA的表达
正常对照组大鼠脑组织有TACE mRNA表达，假手术组与正常对照组脑组织TACE mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。模型组在缺血半暗带区与缺血中心区相比TACE mRNA表达无显著性差异(P>0.05)，且其表达规律相同，分别在脑缺血再灌注3h和12～24h达高峰(P<0.01);在脑缺血再灌注6h与48h表达下降，而在脑缺血再灌注72h表达低于正常对照组(P<0.05或P<0.01);随后在7、14d渐消失，未能检测到TACE mRNA水平，直至21d出现低水平表达。见表1。表1 各组大鼠脑组织不同部位TACE mRNA表达值动态变化(略)
3 讨 论
TACE是一种新近发现并克隆的蛋白水解酶，为ADAM成员之一，属于Ⅰ型跨膜蛋白，开放阅读框编码824氨基酸，具有ADAM家族的保守序列、信号肽、前肽、金属蛋白酶区、解整合素区、跨膜区和胞浆区;TA-CE广泛分布于人体各组织器官，在细胞表面大量表达，当细胞激活后其水平下降[1～3] 。TACE主要功能是加工水解跨膜型TNF.α(TM.TNF.α，26kD)而产生分泌性TNF.α(sTNF.α，17kD)，并介导细胞因子及受体脱落调节其生物学特性
[6] 。
研究证实，脑缺血后TNF.α参与了脑组织损伤与修复。脑组织中TNF.α的活性受到TACE的调控，Car-denas等[7] 运用短暂大脑中动脉闭塞大鼠模型作为缺血预适应(IPC)来研究TACE表达，同时研究对TNF.α的释放作用，发现在IPC后TACE表达增加，促使TNF.α释放，且可被选择性TACE抑制剂BB.1101阻滞。证实IPC后脑组织TACE表达上调，对IPC的TNF.α脱落有重要作用。本研究主要研究了TACE mRNA在脑缺血再灌注后急慢性期的表达，发现脑缺血再灌注早期其过度表达有两个高峰，与脑缺血再灌注早期脑组织损伤相一致[2] ;至脑缺血恢复期则以修复为主，而实验发现TACE mRNA表达下调。由此可见，脑缺血再灌注后脑组织存在TACE mRNA的差异表达，在脑缺血再灌注早期TACE mRNA表达过度，与脑缺血再灌注损伤程度相关，其作用机制可能与可调节TNF.α的活性有关。只有进一步观察TACE蛋白与其下游调节产物的表达规律，及通过干预处理观察它们的表达变化，才能更全面的了解其表达规律及作用机制。
[参考文献]
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(1.中南大学湘雅三医院神经内科，湖南长沙 410013;2.东南大学附属中大医院神经内科，江苏南京 210009)
[作者简介] 徐海清(1975-)，男，江西丰城人，住院医师，现工作单位为东南大学附属中大医院神经内科。
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