川芎嗪对哮喘大鼠血清Ｐ选择素表达的影响
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[摘要]
目的 探讨不同时段哮喘大鼠血清P选择素(Pselectin)的表达及川芎嗪对其干预的作用机制。方法 以卵蛋白致敏制备大鼠哮喘模型，腹腔注射川芎嗪、地塞米松及川芎嗪+地塞米松(联合用药)进行干预，分别在激发干预后的1、2周取血清进行双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ABCELISA)测定血清P选择素水平。结果 正常大鼠血清P选择素有少量表达，在激发哮喘后1周血清P选择素的表达显著升高(P<0001)，2周后较第1周升高更加明显。各药物干预组血清P选择素的表达均高于正常对照组但低于哮喘模型组，且随着干预时间的延长降低幅度增大；川芎嗪大剂量组与地塞米松组作用相似，在干预至2周时大鼠血清P选择素水平接近正常，两组降低的幅度均大于川芎嗪小剂量组和联合用药组；川芎嗪小剂量组和联合用药组间无显著差异(P>005)。结论 哮喘大鼠血清P选择素过量表达与哮喘的发生发展密切相关，并在早期即参与哮喘的发病。川芎嗪可在早期通过抑制P选择素的过度表达而阻止哮喘的进一步发展。
[关键词] 哮喘；P选择素；川芎嗪
[中图分类号] R33；R562.25
P选择素是黏附分子的一种，通过介导嗜酸性粒细胞的募集、中性粒细胞在活化内皮细胞上的滚动，以及增加气道高反应性等方面参与哮喘的发生发展。但随着哮喘的进展，血清P选择素水平如何变化及川芎嗪对它有何影响，国内外尚未见详尽报道。本研究通过观察哮喘大鼠模型不同时段血清P选择素的表达情况，从而进一步阐明血清P选择素在哮喘不同时段的变化和川芎嗪对其的干预机制，为临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
动物：健康雄性SD大鼠96只，体重220～250 g(上海中国科学院实验动物中心提供)。
主要试剂及药品：鸡卵清蛋白(ovalbulium，OVA，Sigma公司)，高温灭活百日咳杆菌(上海生物研究所)，大鼠可溶性P选择素定量ELISA试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)，川芎嗪注射液(天津金耀制药厂)，地塞米松注射液(南京第二制药厂)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠哮喘模型的制备
参照文献[1]方法。以10%OVA1ml+氢氧化铝100 mg+灭活百日咳杆菌疫苗(5×109个)腹腔注射使大鼠致敏，2周后以1%OVA溶液雾化吸入激发大鼠哮喘，以致敏大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、哮鸣音、口唇发绀、腹肌收缩痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为模型建立成功。正常对照组在第0天腹腔注射生理盐水2 ml，2周后用生理盐水雾化吸入，其余处理均同哮喘组。
1.2.2 实验分组
大鼠分为6组，即正常对照组、哮喘模型组、川芎嗪大剂量组、川芎嗪小剂量组、地塞米松组、川芎嗪+地塞米松组(联合用药组)，每组16只。哮喘模型组和各药物干预组腹腔注射OVA致敏，2周后，将大鼠置于透明密闭容器给予1%OVA雾化吸入激发哮喘，中等雾量，每次20 min。哮喘模型组激发前以生理盐水腹腔注射；各药物干预组在每次激发前30min分别给予川芎嗪(大剂量组80 mg·kg-1，小剂量组40 mg·kg-1)、地塞米松(05 mg·kg-1)及联合用药(川芎嗪40 mg·kg-1+地塞米松025 mg·kg-1)腹腔注射，其余均同哮喘组；以上各组动物均于激发后1、2周最后1次激发24 h内随机各处死8只大鼠，收集血清标本。
1.2.3 血清标本的采集及血清P选择素的测定
自大鼠股动脉采血，离心后留存血清，置于-70℃保存，1周内进行ELISA检测。测试时严格按照试剂盒使用说明，由专人进行操作。
1.2.4 统计学方法
所得数据以x-±s表示，采用SPSS11.5统计软件处理数据，两组间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析。P<005时表示差异有显著性。
2 结果
2.1 哮喘大鼠模型的鉴定
致敏大鼠雾化激发后出现呼吸加快、打喷嚏、口周发绀、烦躁不安等表现；哮喘模型组有明显腹肌痉挛、点头呼吸及倦伏，各干预组也可见不同程度类似表现但较哮喘模型组轻，正常对照组则没有上述症状。
2.2 不同时段各组大鼠血清P选择素的表达
见表1。
表1 不同时段各组大鼠血清P选择素的表达(略)
表1显示，P选择素在正常大鼠血清中稍有表达；激发和干预1周时，与正常对照组相比，哮喘模型组大鼠血清P选择素水平明显升高(P<0001)，各干预组大鼠血清P选择素水平也有显著升高(P<005)。在各干预组之间，川芎嗪大剂量组比地塞米松组略高，但两者之间差异无统计学意义(P>005)；川芎嗪小剂量组与联合用药组之间差异无统计学意义，但与川芎嗪大剂量组和地塞米松组相比有显著差异(P<005)。激发和干预至2周时，哮喘模型组大鼠血清P选择素水平继续升高且与第1周相比有显著差异(P<005)；各药物干预组血清P选择素水平开始下降，其中川芎嗪大剂量组降低程度大于川芎嗪小剂量组和联合用药组，与地塞米松组相近，略高于正常对照组但后两者差异均无统计学意义(P>005)；川芎嗪小剂量和联合用药组间血清P选择素水平差异无统计学意义，但均低于哮喘模型组(P<005)。
3 讨论
支气管哮喘(哮喘)[2]是一种由于对触发因素具有高反应性而引起气道阻力增高的慢性阻塞性呼吸道炎症病变,其特征性表现为活化的嗜酸性粒细胞选择性地募集于周围支气管，从而引起气道的炎症反应和高反应性，其严重性在某种程度上与支气管周围炎症相关。有文献[3]报道，P选择素在由过敏因素引起的气管炎症和气道高反应性方面扮演着重要角色。
P选择素为黏附分子选择素家族中的一员，表达于巨核细胞、活化血小板和活化的内皮细胞。它介导中性粒细胞在活化内皮细胞上的滚动，是调控嗜酸性粒细胞浸润至肺并引起炎症的关键因素[4]，尤其在炎症过程的早期更为重要。目前研究表明，炎症反应的初始阶段由于抗原激发使肥大细胞和Th2细胞激活，组织中的肥大细胞聚集到气道炎症部位并释放IL1、TNFα和组胺等炎性介质，这些介质可刺激内皮细胞表达P选择素[5]。P选择素有一个重要配体CD162即P选择素糖蛋白配体 1(Pselectin glycoprotein ligand1,PSGL1)，P选择素可与PSGL1结合从而介导炎症细胞募集于周围支气管，同时促进炎症细胞与内皮细胞黏附,使这些细胞向毛细血管壁移动,并沿血管内皮滚动，引起局部炎症反应。有研究[3]表明，血清P选择素水平升高可以导致气道高反应性，而且其会脱落入血液后成为可溶性成分，是评价哮喘炎症反应的重要指标之一[6]。因此，探讨如何抑制P选择素的表达对控制哮喘的发生发展有重要价值。
本实验通过双抗体夹心ABCELISA方法来测定哮喘大鼠血清P选择素表达情况，结果显示，正常大鼠血清P选择素有少量表达，激发哮喘后血清P选择素表达明显上调，且随着激发时间的延长升高更加明显。提示血清P选择素与哮喘的病变程度有关，并且在早期就发挥了重要作用，这种作用随着哮喘疾病的进展而增强。选择性抑制P选择素介导的白细胞与内皮细胞间的相互作用,可以减弱炎症过程,从而减轻过敏性疾病的症状。John等[7]的实验表明，封闭大鼠的P选择素基因序列，可以显著减轻哮喘大鼠气管周围嗜酸性粒细胞的炎性聚集，抑制嗜酸粒细胞从外周血渗入呼吸道以及嗜酸粒细胞和淋巴细胞向肺部炎症组织趋化浸润和气道高反应性。因此，在病理状态下，通过药物抑制血清P选择素的表达是抑制细胞黏附和炎症反应的重要途径，有利于在早期控制哮喘的发展。
本实验中发现，川芎嗪干预后血清P选择素表达明显减弱，且大剂量组优于小剂量组和联合用药组，随着干预时间延长，大剂量组血清P选择素表达逐渐降低并接近正常对照组，与地塞米松组作用结果相似，提示川芎嗪对哮喘大鼠血清P选择素的表达有良好的抑制作用，且存在时间和剂量依赖性。这可能与川芎嗪改善了气道周围组织的血液淤滞状态，使局部组织的理化环境恢复正常，从而阻断了哮喘发生过程中的微循环障碍有关。实验中发现川芎嗪小剂量组血清P选择素的表达与大剂量组比较差异有统计学意义，提示小剂量用药起效慢，作用强度有限。有关川芎嗪使用的具体剂量及作用时间有待进一步研究。中医药治疗哮喘已有几千年的经验和独特的治疗效果，川芎嗪来源容易，成本低廉，临床疗效可靠且无毒副作用，有较高的临床应用价值。
[参考文献]
[1]吕国平.介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法[J]. 中华结核病和呼吸杂志，1995，18(6):317318.
[2]ELISA J A，LEE C G，ZHENG T,et al.New insights into the pathogenesis of asthma [J]. Clin Invest，2003,111(3):291297.
[3]于化鹏,任锦云,王富强,等. P选择素在速激肽类致气道高反应性中的作用[J].中华内科杂志，1999,38(4):228230
[4]SJOSWARD K N,UPPUGUNDURI S,SCHMEKEL B.Decreased serum levels of Pselectin and eosinophil cationic protein in patients with mild asthma after inhaled salbutamol [J].Respiration,2004,71(3):241245.
[5]WAGNER D D. Pselectin chases a butterfly [J]. Clin Invest,1995,95(5):19551956.
[6]陈树宝.儿科新理论与新技术[M]. 上海:上海科技教育出版社，1996：11.
[7]JOHN A E,LUKACS N W,BERLIN A A,et al.Discovery of a potent nanoparticle Pselectin antagonist with antiinflammatory effects in allergic airway disease [J]. FASEB,2003,17(15):22962298.
东南大学附属中大医院 儿科，江苏 南京 210009
无锡市儿童医院 呼吸科，江苏 无锡 214000
扬州市第一人民医院 儿科，江苏 扬州 225002
[基金项目] 东南大学科学基金项目(9247341175)
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