Ｐ63和ＰＴＥＮ基因蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
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参见附件(182KB，3页)。
[摘要]
目的 探讨食管鳞状细胞癌(ESC)组织中P63和PTEN基因蛋白与肿瘤临床病理的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测20例正常食管粘膜及65例ESC组织中P63和PTEN蛋白表达，分析P63和PTEN表达与ESC临床病理特征及预后的关系。结果 在ESC中，P63和PTEN表达阳性率分别为86.2%(40/65)和58.5%(38/65),在正常食管粘膜组织中，P63和PTEN阳性率分别为300%(6/20)和1000% (20/20)，两者差异均有显著性(P<005)。P63高表达和PTEN低表达均与肿瘤分化、浸润、淋巴结转移及预后相关(P<005)。P63表达与PTEN表达呈负相关(χ2=4.01,P<005)。结论 P63和PTEN异常表达与ESC的病理生物学行为密切相关，可作为预测ESC转移潜能、评估ESC患者预后的客观指标。
[关键词] 食管肿瘤；鳞状细胞癌；P63；PTEN；基因表达
[中图分类号] R735.1
P63是新发现的P53蛋白的同源蛋白，可能参与上皮组织的正常发生、分化以及形态学的发生，并可以促进肿瘤的生长和侵袭转移。磷酸酯酶(phoshatase and tension homology deleted on chromosome fen,PTEN)是一种新型抑癌基因，其在人类许多原发肿瘤和细胞株发生缺失，并导致肿瘤细胞无限制生长。p63和PTEN基因表达均与肿瘤的侵袭和转移有关。我们应用免疫组织化学方法检测P63和PTEN蛋白在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous carcinoma,ESC)组织中的表达情况，旨在探讨P63和PTEN蛋白表达与ESC的发生、发展、临床病理学特征及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院1994年1月～2003年12月间手术切除并经病理诊断为ESC标本65例，其中男55例，女10例，年龄35～78岁，平均58.6岁。按细胞分化程度分为高分化癌42例，低分化癌23例。取距肿物4 cm以外的正常食管粘膜组织20份作为对照。标本均经10%甲醛固定、石蜡包埋，4～5 μm厚连续切片。
1.2 方法
1.2.1 试剂来源
鼠抗人P63、PTEN单克隆抗体和LSAB试剂盒购自迈新生物技术公司(均为即用型)。
1.2.2 免疫组织化学检测方法
采用微波LSAB法。即切片常规脱蜡水化后，放入PBS(枸橼酸缓冲液,10 mmol·L-1,pH 6.0)内，用YWY781A型医用微波仪170 W辐射抗原修复处理5 min，冷却后水洗。其他操作流程同常规LSAB法，所不同处为三步抗原孵育和正常羊血清封闭均用微波仪130W各辐射处理5 min,保温2 min即可。H2O2DAB显色。实验用已知P63阳性鼻咽癌和PTEN阳性子宫内膜腺癌组织作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。
1.2.3 结果判断
P63和PTEN染色阳性信号呈棕黄色。P63以细胞核显示棕黄色颗粒为阳性，PTEN以细胞质显示棕黄色颗粒为阳性。根据染色强度及显色癌细胞比例将2种基因蛋白表达状况分为4级：未见棕黄色颗粒为阴性(-)，阳性细胞数<25%为弱阳性(+)，25%～75%为阳性(++)，>75%为强阳性(+++)。(+)以上为阳性结果。
1.2.4 统计学处理
组间差异采用χ2检验，P<005为有显著性差异。
2 结果
2.1 P63和PTEN在正常食管粘膜和ESC中的表达
P63阳性染色定位于细胞核(图1)，65例ESC中56例呈P63阳性表达，阳性率为86.2%；20例正常食管粘膜中6例呈P63阳性表达，阳性率为30.0%,两者差异有显著性(χ2=24.43,P<005)。PTEN阳性染色定位于细胞质(图2)，65例ESC中38例呈PTEN阳性表达，阳性率为58.5%；20例正常食管粘膜组织均呈PTEN阳性表达，阳性率为1000%,两者差异有显著性(χ2=8.82,P<005)。
图1 ESC细胞核P63免疫组化阳性染色 微波LSAB法×400(略)
图2 ESC细胞质PTEN免疫组化阳性染色 微波LSAB法×400 (略)
2.2 P63和PTEN表达与ESC临床病理特征和预后的关系
65例食管癌术后进行2年以上随访，其中死亡44例，尚生存21例。P63和PTEN表达与ESC患者的性别、年龄和肿瘤大小均无关。随着ESC组织的分化程度的减低、浸润程度的增高、淋巴结的转移及患者的死亡，P63表达阳性率均随之显著增高(P<005)，PTEN表达阳性率则显著降低(P<005)，见表1。
表1 P63和PTEN表达与ESC临床病理特征和预后的关系例(略)
注：括号内为百分比
2.3 ESC中P63与PTEN表达的关系
在P63阳性的56例ESC中，PTEN阳性表达为29例(51.8%)，在P63阴性的9例ESC中，PTEN均呈阳性表达(100%)，P63阳性的ESC中PTEN阳性率与P63阴性的ESC中的PTEN阳性率之间差异有显著性(χ2=4.01,P<005)。
3 讨论
p63基因是1998年Yang等在人类及大鼠基因组中发现的一个与p53同源的基因家族新成员，定位于3q273q29，在结构与功能上都与p53有高度的同源性，被认为是p53家族的新成员。p63基因在肿瘤中的高表达，可以抑制野生型P53的活性，阻止野生型P53诱导的细胞凋亡，以促进肿瘤的生长和发展。近年来研究发现，P63主要表达于鳞癌组织中，且随着肿瘤分化程度的升高而降低，而在腺癌组织中的表达极低或不表达，认为P63的表达可能与某种程度的鳞状上皮相关性基因的表达潜能有关[13]。本观察结果显示，在正常食管粘膜组织中P63表达率很低，而且阳性物质仅见于基底层或内基底细胞。在ESC组织中，P63表达较强烈，阳性细胞数呈弥漫性分布；P63表达阳性率越高，ESC分化程度越低、浸润和转移程度越高，患者死亡率就越高(P<005)。提示P63表达与ESC细胞的增殖、恶性转化以及癌细胞的恶性程度和生物学行为密切相关，P63高表达可能是ESC发生的早期事件。检测ESC组织中的p63基因蛋白表达，不仅对研究ESC的发生发展是一个较为可靠的重要标志物，而且可作为判断患者预后的可靠参考指标。
PTEN基因是1997年在染色体10q23上克隆到的一种新型抑癌基因。通过结构预测显示，PTEN与细胞骨架蛋白和张力蛋白高度同源，提示PTNE可能参与细胞骨架重组并影响细胞迁移能力。当PTEN抑癌基因突变或缺失可能构成一个新的信号转导途径，在调节细胞的增生和死亡、转移和粘连等方面均起重要作用，与人类恶性肿瘤的发生、发展关系密切[45]。本观察结果显示，在正常食管粘膜组织中PTEN表达阳性率为100%，明显高于ESC组织的表达率(P<005)；并随着癌组织分化程度减低、浸润和转移程度增高，PTEN阳性表达率逐渐降低；PTEN表达阳性率越低患者死亡率就越高(P<005)。提示PTEN表达与ESC的发生、细胞恶性转化密切相关，在ESC的转移过程中起着重要的抑制作用，可能是ESC的发生和临床进展过程中的晚期事件。在临床病理活检中，检测其基因蛋白表达可作为预测肿瘤转移潜能和预后的参考指标。
恶性肿瘤的发生、发展是一个涉及多基因、多分子水平变化的多阶段过程。在其过程中不同功能的基因对细胞所产生的影响协同地增加了细胞的癌变。有关ESC中p63和PTEN基因表达的相关性研究未见报道。本研究发现，在ESC组织中P63表达与PTEN表达呈明显负相关，提示在ESC的发生发展和侵袭转移的复杂过程中，p63基因与PTEN基因可能具有协同作用。其分子机制尚待进一步深入探讨。
[参考文献]
[1]MASSION P P,TATLAM P M,JAMSHRDUR RAHMAN S M,et al.Significance of P63 amolification and overexpression in lung cancer development and prognosis[J]. Cancer Res,2003,63(21):71137121.
[2]贾海英,王继群.p63与头颈部鳞癌[J].国外医学耳鼻咽喉科分册,2005,29(1):35.
[3]GEDDERT H,KIEL S,HEEP H J,et al.The role of P63 and deltaNp63(P40) protein expression and gene amolification in esophageal carcinogenesis[J].Hum Pathol，2003,34(9):850856.
[4]谷化平,尚培中,冯骥良.PTEN和P16基因蛋白在胆囊癌组织中的表达[J].中国中西医结合消化杂志,2005,13(4):261263.
[5]郑华川,陈颖,祝立革,等.PTEN编码产物在胃癌发生发展不同阶段中的表达及意义[J].中华肿瘤杂志,2003,25(1):1316.
[收稿日期] 20051221
中国人民解放军第251医院 病理科，河北 张家口 075000
中国人民解放军第251医院 普外科，河北 张家口 075000
[摘要]
目的 探讨食管鳞状细胞癌(ESC)组织中P63和PTEN基因蛋白与肿瘤临床病理的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测20例正常食管粘膜及65例ESC组织中P63和PTEN蛋白表达，分析P63和PTEN表达与ESC临床病理特征及预后的关系。结果 在ESC中，P63和PTEN表达阳性率分别为86.2%(40/65)和58.5%(38/65),在正常食管粘膜组织中，P63和PTEN阳性率分别为300%(6/20)和1000% (20/20)，两者差异均有显著性(P<005)。P63高表达和PTEN低表达均与肿瘤分化、浸润、淋巴结转移及预后相关(P<005)。P63表达与PTEN表达呈负相关(χ2=4.01,P<005)。结论 P63和PTEN异常表达与ESC的病理生物学行为密切相关，可作为预测ESC转移潜能、评估ESC患者预后的客观指标。
[关键词] 食管肿瘤；鳞状细胞癌；P63；PTEN；基因表达
[中图分类号] R735.1
P63是新发现的P53蛋白的同源蛋白，可能参与上皮组织的正常发生、分化以及形态学的发生，并可以促进肿瘤的生长和侵袭转移。磷酸酯酶(phoshatase and tension homology deleted on chromosome fen,PTEN)是一种新型抑癌基因，其在人类许多原发肿瘤和细胞株发生缺失，并导致肿瘤细胞无限制生长。p63和PTEN基因表达均与肿瘤的侵袭和转移有关。我们应用免疫组织化学方法检测P63和PTEN蛋白在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous carcinoma,ESC)组织中的表达情况，旨在探讨P63和PTEN蛋白表达与ESC的发生、发展、临床病理学特征及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院1994年1月～2003年12月间手术切除并经病理诊断为ESC标本65例，其中男55例，女10例，年龄35～78岁，平均58.6岁。按细胞分化程度分为高分化癌42例，低分化癌23例。取距肿物4 cm以外的正常食管粘膜组织20份作为对照。标本均经10%甲醛固定、石蜡包埋，4～5 μm厚连续切片。
1.2 方法
1.2.1 试剂来源
鼠抗人P63、PTEN单克隆抗体和LSAB试剂盒购自迈新生物技术公司(均为即用型)。
1.2.2 免疫组织化学检测方法
采用微波LSAB法。即切片常规脱蜡水化后，放入PBS(枸橼酸缓冲液,10 mmol·L-1,pH 6.0)内，用YWY781A型医用微波仪170 W辐射抗原修复处理5 min，冷却后水洗。其他操作流程同常规LSAB法，所不同处为三步抗原孵育和正常羊血清封闭均用微波仪130W各辐射处理5 min,保温2 min即可。H2O2DAB显色。实验用已知P63阳性鼻咽癌和PTEN阳性子宫内膜腺癌组织作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。
1.2.3 结果判断
P63和PTEN染色阳性信号呈棕黄色。P63以细胞核显示棕黄色颗粒为阳性，PTEN以细胞质显示棕黄色颗粒为阳性。根据染色强度及显色癌细胞比例将2种基因蛋白表达状况分为4级：未见棕黄色颗粒为阴性(-)，阳性细胞数<25%为弱阳性(+)，25%～75%为阳性(++)，>75%为强阳性(+++)。(+)以上为阳性结果。
1.2.4 统计学处理
组间差异采用χ2检验，P<005为有显著性差异。
2 结果
2.1 P63和PTEN在正常食管粘膜和ESC中的表达
P63阳性染色定位于细胞核(图1)，65例ESC中56例呈P63阳性表达，阳性率为86.2%；20例正常食管粘膜中6例呈P63阳性表达，阳性率为30.0%,两者差异有显著性(χ2=24.43,P<005)。PTEN阳性染色定位于细胞质(图2)，65例ESC中38例呈PTEN阳性表达，阳性率为58.5%；20例正常食管粘膜组织均呈PTEN阳性表达，阳性率为1000%,两者差异有显著性(χ2=8.82,P<005)。
图1 ESC细胞核P63免疫组化阳性染色 微波LSAB法×400(略)
图2 ESC细胞质PTEN免疫组化阳性染色 微波LSAB法×400 (略)
2.2 P63和PTEN表达与ESC临床病理特征和预后的关系
65例食管癌术后进行2年以上随访，其中死亡44例，尚生存21例。P63和PTEN表达与ESC患者的性别、年龄和肿瘤大小均无关。随着ESC组织的分化程度的减低、浸润程度的增高、淋巴结的转移及患者的死亡，P63表达阳性率均随之显著增高(P<005)，PTEN表达阳性率则显著降低(P<005)，见表1。
表1 P63和PTEN表达与ESC临床病理特征和预后的关系例(略)
注：括号内为百分比
2.3 ESC中P63与PTEN表达的关系
在P63阳性的56例ESC中，PTEN阳性表达为29例(51.8%)，在P63阴性的9例ESC中，PTEN均呈阳性表达(100%)，P63阳性的ESC中PTEN阳性率与P63阴性的ESC中的PTEN阳性率之间差异有显著性(χ2=4.01,P<005)。
3 讨论
p63基因是1998年Yang等在人类及大鼠基因组中发现的一个与p53同源的基因家族新成员，定位于3q273q29，在结构与功能上都与p53有高度的同源性，被认为是p53家族的新成员。p63基因在肿瘤中的高表达，可以抑制野生型P53的活性，阻止野生型P53诱导的细胞凋亡，以促进肿瘤的生长和发展。近年来研究发现，P63主要表达于鳞癌组织中，且随着肿瘤分化程度的升高而降低，而在腺癌组织中的表达极低或不表达，认为P63的表达可能与某种程度的鳞状上皮相关性基因的表达潜能有关[13]。本观察结果显示，在正常食管粘膜组织中P63表达率很低，而且阳性物质仅见于基底层或内基底细胞。在ESC组织中，P63表达较强烈，阳性细胞数呈弥漫性分布；P63表达阳性率越高，ESC分化程度越低、浸润和转移程度越高，患者死亡率就越高(P<005)。提示P63表达与ESC细胞的增殖、恶性转化以及癌细胞的恶性程度和生物学行为密切相关，P63高表达可能是ESC发生的早期事件。检测ESC组织中的p63基因蛋白表达，不仅对研究ESC的发生发展是一个较为可靠的重要标志物，而且可作为判断患者预后的可靠参考指标。
PTEN基因是1997年在染色体10q23上克隆到的一种新型抑癌基因。通过结构预测显示，PTEN与细胞骨架蛋白和张力蛋白高度同源，提示PTNE可能参与细胞骨架重组并影响细胞迁移能力。当PTEN抑癌基因突变或缺失可能构成一个新的信号转导途径，在调节细胞的增生和死亡、转移和粘连等方面均起重要作用，与人类恶性肿瘤的发生、发展关系密切[45]。本观察结果显示，在正常食管粘膜组织中PTEN表达阳性率为100%，明显高于ESC组织的表达率(P<005)；并随着癌组织分化程度减低、浸润和转移程度增高，PTEN阳性表达率逐渐降低；PTEN表达阳性率越低患者死亡率就越高(P<005)。提示PTEN表达与ESC的发生、细胞恶性转化密切相关，在ESC的转移过程中起着重要的抑制作用，可能是ESC的发生和临床进展过程中的晚期事件。在临床病理活检中，检测其基因蛋白表达可作为预测肿瘤转移潜能和预后的参考指标。
恶性肿瘤的发生、发展是一个涉及多基因、多分子水平变化的多阶段过程。在其过程中不同功能的基因对细胞所产生的影响协同地增加了细胞的癌变。有关ESC中p63和PTEN基因表达的相关性研究未见报道。本研究发现，在ESC组织中P63表达与PTEN表达呈明显负相关，提示在ESC的发生发展和侵袭转移的复杂过程中，p63基因与PTEN基因可能具有协同作用。其分子机制尚待进一步深入探讨。
[参考文献]
[1]MASSION P P,TATLAM P M,JAMSHRDUR RAHMAN S M,et al.Significance of P63 amolification and overexpression in lung cancer development and prognosis[J]. Cancer Res,2003,63(21):71137121.
[2]贾海英,王继群.p63与头颈部鳞癌[J].国外医学耳鼻咽喉科分册,2005,29(1):35.
[3]GEDDERT H,KIEL S,HEEP H J,et al.The role of P63 and deltaNp63(P40) protein expression and gene amolification in esophageal carcinogenesis[J].Hum Pathol，2003,34(9):850856.
[4]谷化平,尚培中,冯骥良.PTEN和P16基因蛋白在胆囊癌组织中的表达[J].中国中西医结合消化杂志,2005,13(4):261263.
[5]郑华川,陈颖,祝立革,等.PTEN编码产物在胃癌发生发展不同阶段中的表达及意义[J].中华肿瘤杂志,2003,25(1):1316.
中国人民解放军第251医院 病理科，河北 张家口 075000
中国人民解放军第251医院 普外科，河北 张家口 075000
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