宫颈组织ＨＰＶ感染与机体局部免疫状态的研究
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[摘要]
目的 探讨宫颈组织不同型别人乳头瘤病毒(HPV)感染后机体局部免疫状态。方法 选择40例因各种宫颈病变行活检的患者，依病理诊断结果将其分为3组，Ⅰ组(15例)为宫颈尖锐湿疣和炎症患者，Ⅱ组(15例)为低度鳞状上皮内瘤变患者，Ⅲ组(10例)为高度鳞状上皮内瘤变及宫颈浸润癌患者。应用PCR法检测其宫颈组织HPV感染及病毒亚型情况，同时采用免疫组化法测定宫颈组织CD4、CD8、Ki67的表达。结果 Ⅰ组HPV感染率为66.7%，分型以6型、11型为主；CD4/CD8≥1者占83.3%,<1者占167%，Ki67(-)～(±)。Ⅱ组HPV感染率73.3%，分型以16型、58型为主；CD4/CD8≥1者占33.3%，<1者占66.7%，Ki67(-)～(++)。Ⅲ组HPV感染率70%，为16及58型感染，CD4/CD8≥1者占200%,CD4/CD8<1者占800%，Ki67(+)～(+++)。结论 HPV感染所致不同类型的宫颈病变机体局部免疫状态有显著性差异；高危型HPV感染者与低危型HPV感染者局部免疫状态无显著差异，但预后不同。
[关键词] 人乳头瘤病毒；亚型；免疫状态；宫颈组织；宫颈病变
[中图分类号] R711.31
人乳头瘤病毒(HPV)感染是女性生殖道尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈浸润癌的主要致病因素[1]。接触HPV后是否发生感染以及感染后的转归均与机体免疫功能状态，尤其是局部细胞免疫密切相关。多数HPV感染是亚临床型的，系统及局部细胞介导的免疫反应减弱是HPV感染并出现临床表现的重要因素[2]。本研究对40例因各种原因行宫颈病变活检患者的宫颈组织，应用PCR法检测HPV感染及病毒亚型情况，同时采用免疫组化法测定其宫颈组织CD4、CD8、Ki67的表达，以了解不同型别HPV感染患者宫颈局部的免疫状态。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象为在东南大学附属中大医院及南京市妇幼保健院门诊行宫颈活检的患者，共40例，年龄22～62岁。排除标准：(1)妊娠和哺乳期妇女；(2)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(3)有严重心、肝、肾功能损害者；(4)2周内接受过系统或局部抗病毒药物治疗者；(5)4周内使用过免疫抑制剂或激活剂者。依病理诊断结果将其分为3组，Ⅰ组：宫颈尖锐湿疣和炎症患者15例，年龄22～62岁，平均(3987±1992)岁；Ⅱ组：低度鳞状上皮内瘤变患者15例，年龄30～46岁，平均(37.80±1018)岁；Ⅲ组：高度鳞状上皮内瘤变及宫颈浸润癌患者10例，年龄28～41岁，平均(3520±1044)岁。各组间均衡性检验无显著性差异。
1.2 标本采集
拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。EP管保存于-70℃冰柜。宫颈活检组织制成石蜡标本待用。
1.3 引物的设计与合成
由上海生工生物公司设计并合成引物序列，查阅Genebank进行基因序列比对，各引物排列顺序见表1。
1.4 试剂来源
TrisHCl、EDTA、SDS、Rnase、蛋白酶K、饱和酚、无水乙醇、琼脂糖、100 bpMarker 由北京天为时代科技公司提供；乙酸钠、氯仿、异戊醇、溴化乙锭由东南大学中心实验室提供；10×PCR缓冲液、dNTP、25 mmol·L-1 MgCl2、Taq酶由上海生工生物公司提供；CD4、CD8、Ki67由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
表1 各引物序列顺序(略)
1.5 HPV及病毒亚型测定
1.5.1 标本核酸提取
将EP管内标本室温融化，13000 r·min-1离心10 min，弃上清，保留管底细胞块，加入1 ml 细胞裂解液 (10 mmol·L-1 TrisHCl，pH 80；01 mol·L-1 EDTA，pH 80；05%SDS；20 μg·L-1 RNase),37℃水浴1h,加入5μl蛋白酶K 50℃振荡水浴3h，加入1ml饱和酚，混匀10min，13000 r·min-1离心30min，转移上清，加入800μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀10 min，13000 r·min-1离心15min，转移上清，加入400μl氯仿/异戊醇(24∶1)，13000 r·min-1离心10 min，加入1/10体积乙酸钠及2倍体积乙醇，-20℃过夜，13000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入70%乙醇1 ml，混匀器混匀至底物腾起，再13000 r·min-1离心10 min，弃上清，凉干，逐量加入TE溶解DNA(每次10 μl)，充分溶解。
1.5.2 PCR扩增
以50μl PCR 反应液进行扩增反应，在冰盒上离心管中依次加入10×PCR 缓冲液 5μl，2mmol·L-1dNTP 5μl，引物1、引物2各2μl，25 mmol·L-1 MgCl28μl，Taq酶 05μl，模板DNA 4μl，加水至总体积50μl。将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为94℃预变性2min；94℃45s，50℃1min，72℃ 1min，循环35次；72℃延伸5min降至4℃。
1.5.3 琼脂糖电泳
配制17%的经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，分别取6 μl HPV各亚型扩增产物及阴性对照(无菌纯水)与2 μl溴酚蓝电泳载样缓冲液混合，100 V电压电泳20～30 min,紫外透射仪上观察结果。电泳凝胶中分别在263、144、576、360、330bp处出现清晰条带与预期扩增片断长度对应，为该型阳性；阴性对照无条带出现。
1.6 宫颈组织CD4、CD8、Ki67免疫组化检测
1.6.1 方法
采用两步法测定。(1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)将切片放入001mol·L-1的枸橼酸缓冲液中，微波92～98℃抗原热修复10～15min，自然冷却至室温，PBS(001 mol·L-1)冲洗3次,各3 min；(3)蒸馏水冲洗；(4)加一抗2、3滴覆盖标本，37℃温育1h，冷却至室温30 min；(5)PBS冲洗3次，各3 min；(6)加入二抗37℃温育1h，冷却至室温30 min；(7)PBS冲洗3次，各3 min;(8)DAB显色；(9)苏木精复染、脱水、透明、封片。
1.6.2 结果判定
每张切片在200倍光镜下观察全部视野，CD4与CD8阳性者表现为淋巴细胞胞膜深染呈黄褐色，胞核不着色；Ki67阳性者表现为细胞核深染呈黄褐色。对各标本CD4、CD8、Ki67进行半定量测定，根据染色阳性面积计算：(-)为未测及，(±)为<10%，(+)为10%～30%，(++)为31%～70%，(+++)为>70%。估算CD4/CD8比值。根据以上免疫组织化学结果判断标准，将Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组患者CD4/CD8、Ki67进行比较，同时对高危型HPV感染者与低危型HPV感染者CD4/CD8、Ki67进行比较，并进行相关性分析。
1.7 统计学处理
由于条件所限，40例研究对象中对HPV阳性的21例患者的宫颈活检石蜡标本进行了免疫组织化学测定，将计量资料收集完整，因n<40，结果均采用Fisher精确概率双侧检验，检验水准α=005。
2 结果
2.1 不同HPV亚型感染与宫颈病变的相关性
HPV临床亚型目前已检测出200余种，本实验选取高危型HPV发病率最高的3个亚型即HPV16、18、58型及低危型HPV中最常见的HPV6、11型进行检测，阳性结果见图1、表2。
图1 HPV亚型阳性表达(略)
表2 各组HPV感染及病毒亚型测定结果例(略)
本组患者HPV感染率为700%。其中高危型HPV感染20例，患者平均39.1岁,以Ⅱ组及Ⅲ组患者居多，占85%(17/20)；低危型HPV8例，患者平均374岁,以Ⅰ组患者居多，占875%(7/8)。HPV16型单纯或混合感染占高危型HPV感染的60%(12/20)，为高危型HPV感染的主要亚型，HPV58型单纯或混合感染占高危型HPV感染的35%(7/20),居高危型HPV感染亚型的第二位。
2.2 CD4、CD8、Ki67在不同宫颈病变局部细胞中表达的观察
CD4、CD8、Ki67阳性细胞见图2。
对21例HPV阳性的宫颈活检石蜡标本进行CD4、CD8、Ki67的免疫组织化学测定，其中Ⅱ组中1例高危型HPV感染者宫颈活检石蜡标本同时未测及CD4、CD8，故不计入CD4/CD8中，测定结果见表3。
图2 CD4、CD8、Ki67的表达 ×200(略)
表3 各组CD4、CD8、Ki67免疫组化测定结果例(略)
注：括号内为百分比
Ⅰ组CD4/CD8<1者占16.7%，Ⅱ组CD4/CD8<1者占66.7%，Ⅲ组CD4/CD8<1者占800%。因对Ⅱ、Ⅲ组CD4/CD8比较无统计学意义，故将Ⅱ、Ⅲ组合并后与Ⅰ组相比，发现不同宫颈病变机体局部免疫状态经统计学处理有显著性差异(P<005)；Ⅰ组患者Ki67阳性均<10%，Ⅱ、Ⅲ组患者Ki67阳性>10%者占933%，两者存在显著性差异(P<001)。
2.3 HPV不同亚型感染与局部细胞CD4、CD8、Ki67表达
见表4。Ⅱ组中1例高危型HPV感染者宫颈活检石蜡标本同时未测及CD4、CD8，故不计入CD4/CD8中。
表4 各型HPV感染者CD4、CD8、Ki67结果例(略)
注：括号内为百分比 高危型HPV感染者与低危型感染者局部CD4/CD8表达经统计学处理无显著性差异(P>005)，Ki67表达有显著性差异(P<005)。
3 讨论
宫颈组织HPV感染在年轻女性中非常常见，多可自然缓解，有效的自身免疫反应，尤其是细胞免疫反应对局部感染状态起到至关重要的作用[34]。免疫功能低下者疾病更容易由亚临床状态向临床状态进展[5]。机体维持正常的免疫功能有赖于各种免疫细胞特别是T细胞亚群之间的相互协作或制约。成熟T细胞可分为CD4+和CD8+细胞，临床上常用CD4/CD8比值作为判断机体免疫功能状态的一项指标,正常值为1.5～2.0，比值<1提示患者免疫调节功能低下。目前研究表明，外周血中很少有HPV特异性T淋巴细胞[3]，故本实验检测宫颈组织活检石蜡标本的CD4/CD8以了解机体局部免疫功能。Ki67蛋白作为肿瘤的增殖标志物，反映细胞的增殖活性，在细胞周期G1、S、G2、M期中表达，是判断疾病预后的一个有价值的分子标志物，82.1%宫颈癌中表达Ki67，Ki67>10%者提示预后不好[6]。
低危型HPV感染常表现为慢性宫颈炎、低度鳞状上皮内瘤变；高危型HPV感染多表现为高度鳞状上皮内瘤变和宫颈浸润癌，本实验结果符合这一结论。我们发现高危型HPV感染者与低危型HPV感染者局部免疫状态比较差异无显著意义(P>005)，但两者Ki67表达有显著差异(P<005)。考虑研究对象均为发现宫颈病变而初次行宫颈活检的患者，这一结果提示：(1)机体局部免疫状态与HPV型别易感性无直接相关。患者免疫功能下降易致HPV感染，但感染亚型并非由机体免疫状态单因素决定，其他如吸烟、性伴数、生育情况、性激素受体水平等亦可能是影响HPV感染亚型的重要因素。(2)机体感染HPV后，引起何种宫颈病变与感染亚型的自身特性有关。HPV基因序列分为早期基因和晚期基因，早期基因E6、E7蛋白为其致癌基因。高危型HPV与低危型HPV相比，其E6、E7蛋白与抑癌基因pRb、p53有更高的亲和力(如高危型HPV E7蛋白同pRb结合能力比低危型HPV E7蛋白高5～10倍)，导致正常细胞周期调节失控[7]并向恶性转化，进而影响机体的免疫状态，影响疾病的发展与预后。(3)高危型HPV感染者与低危型HPV感染者之间Ki67的表达存在显著差异(P<005)，高危型HPV感染者Ki67表达明显增高，提示预后不好。因此，对宫颈病变应尽可能检测有无HPV感染及感染型别以预测疾病发展结局；对高危型HPV感染者的各种宫颈病变处理均应慎重，并密切随访。
对本组1例HPV16型感染的宫颈CINⅠ患者随访1个月显示，其临床表现、病理诊断、CD8、Ki67前后无明显改变，而CD4由(+)转(-)，CD4/CD8比值下降，提示在无临床干预状态下，疾病的发展首先表现为机体免疫状态的下降。扩大样本数并对不同HPV亚型感染者进行追踪随访，可能更有利于了解宫颈组织HPV感染与局部免疫状态的相关性。
另外，有研究报道，在HPV感染所致各种疾病中，CD4分泌的IL2,IFNγ+、TNFα+在高度鳞状上皮内瘤变及宫颈癌组中较低度鳞状上皮内瘤变及感染已控制者明显降低；CD8分泌的IL2在各组中都明显降低，但IFNγ+、TNFα+在各组无明显差别。提示IL2在针对HPV感染的细胞免疫中起主要作用[5]，对T细胞分泌的各种细胞因子进行测定是了解机体细胞免疫状态的更精确的方法。
[参考文献]
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(东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)
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