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川芎嗪对哮喘大鼠Ｔｈ2型细胞因子作用的研究

http://www.100md.com 2006年10月1日金蕊杨莉陈径李羚唐珩

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    参见附件(362KB，3页)。

     [摘要]目的探讨川芎嗪对哮喘大鼠白细胞介素4(IL4)、白细胞介素13(IL13)水平的影响及其防治哮喘的作用机制。方法 60只SD大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、小剂量及大剂量川芎嗪组、联合用药组，以卵蛋白致敏和激发制备大鼠哮喘模型，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL4、IL13的水平。结果哮喘模型组BALF中IL4、IL13水平均高于正常对照组(P<0001)；地塞米松组和川芎嗪治疗各组均显著低于哮喘模型组(P<0001);川芎嗪大剂量组和联合用药组降低IL4和IL13的作用与地塞米松组无显著性差异(P>005);川芎嗪大剂量组降低IL4的作用与川芎嗪小剂量组无显著性差异(P>005),川芎嗪大剂量组降低IL13的作用优于川芎嗪小剂量组(P<005)；BALF中IL4和IL13水平呈显著正相关(r=0714，P<001)。结论川芎嗪通过抑制IL4和IL13的水平而抑制哮喘气道炎症。

    [关键词]川芎嗪；白细胞介素4；白细胞介素13；支气管哮喘；大鼠

    Effects of ligustrazine on the levels of IL4，IL13 in asthmatic rats

    JIN Rui, YANG Li, CHEN Jing, LI Ling, TANG Heng(Department of Pediatrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009,China)

    Abstract: Objective To explore the changes of the levels of interleukin4(IL4)，interleukin13(IL13) in asthmatic rats and to evaluate the influence of ligustrazine on themMethods Sixty male SD rats were randomly divided into 6 experimental groups(10 in each): normal control group, asthmatic model group, desamethasone group, lowdose of ligustrazine group, highdose of ligustrazine group, combinative therapy groupThe asthmatic model was established by repeated inhalation of ovalbulium The levels of IL4 and IL13 in bronchoalveolar fluid (BALF) were measured by ELISAResults The IL4 and IL13 levels were much higher(P<0001) in BALF in asthmatic model group than those in normal control group. The IL4 and IL13 levels in each treatment group were significantly lower than those in asthmatic model group (P<0.05), but were higher than those in normal control group(P<005), but the levels in highdose of ligustrazine group and combinative therapy group had no significant difference with those in desamethasone group(P>005). The IL4 level in BALF in highdose of ligustrazine group had no significant difference with that in lowdose of ligustrazine group (P>005). The IL13 level in BALF in highdose of ligustrazine group was lower than that in lowdose of ligustrazine group(P<005). A positive correlation between IL4 and IL13 levels in BALF was demonstrated(r=0714, P<001). Conclusion ligustrazine can downregulate the levels of IL4 and IL13 in asthmatic rats and inhibit the airway inflammation

    Key words: ligustrazine； interleukin4； interleukin13； bronchil asthma; rats

    (Modern Medical Journal, 2006,34:327329)

    支气管哮喘是一种由多种细胞、细胞因子和炎症介质引起的、以气道高反应为特征的慢性炎症性疾病，细胞因子是介导和维持支气管哮喘气道特异性炎症和局部免疫反应的主要基础。尤其是Th2型细胞因子，处于支气管哮喘发病机制研究的中心地位[1]。其中白细胞介素4(IL4)和白细胞介素13(IL13)是两个重要的介导变态反应的Th2型细胞因子，它们的过度增加可诱发变态反应,如出现气道高反应性、嗜酸粒细胞性炎症、IgE增高等,也与多种黏附分子及趋化因子表达增多、支气管杯状细胞分泌黏液增多和气道上皮纤维化有关[2]。本研究通过观察川芎嗪对哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL4、IL13水平的影响，探讨IL4和IL13在哮喘发病机制中的作用及川芎嗪对哮喘的干预机制。

     1 材料与方法

    11 材料

    1.1.1 动物健康雄性SD大鼠60只，体重180～220g，由东南大学医学院动物实验中心提供。

    1.1.2 仪器及试剂川芎嗪，浓度为20mg·ml-1，上海第一生化药业公司生产，批号021201；地塞米松磷酸钠注射液，5mg·ml-1，南京第二制药厂生产，批号021205；大鼠IL4 ELISA试剂盒(灵敏度8pg·ml-1)购自深圳晶美生物工程有限公司；IL13 ELISA试剂盒(灵敏度4pg·ml-1) 购自大连泛邦化工技术开发有限公司。雾化吸入器，南京道芬电子有限公司出品；台式高速冷冻离心机，德国Heraeus公司产品；550型酶标阅读仪，美国BIORAD公司产品。

    12 方法

    121 哮喘模型的制备及分组模型制备：参照文献[3]的方法第1天给大鼠腹腔注射2ml的造模液(含卵蛋白100mg、氢氧化铝干粉100mg、灭活百日咳杆菌5×109个)致敏，第14～21天用超声雾化器给大鼠雾化吸入1%卵蛋白生理盐水悬液，每天20min，进行激发。最后1次激发后24h内采集标本。将60只大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、大剂量川芎嗪组、小剂量川芎嗪组和联合用药组6组，每组10只，后4组第14～21天每天激发前30min分别以地塞米松05mg·kg-1、川芎嗪80mg·kg-1、川芎嗪40mg·kg-1、地塞米松025mg·kg-1+川芎嗪40mg·kg-1腹腔注射。致敏和激发过程中有10只大鼠死亡。

    122 标本的采集大鼠处死后仰卧位置于手术板上，棉线固定四肢及两上门齿。剪开颈部皮肤，暴露气管，在第2、3软骨环间行一倒“T”形切口，将去头的静脉输液针插入约15cm，以0号手术丝线结扎固定。静脉输液针接一次性10ml注射器(去针头)，每次抽001 mol·L-1 PBS溶液8ml(0～4℃预冷)，缓慢注入大鼠支气管肺中(不停留)，立即缓慢抽回，反复3次，回收>80%。回收的支气管肺泡灌洗液(BALF)注入冷冻管中，4℃ 3000r·min-1离心10min，取上清液分装，-70℃低温冰箱保存待测。用4%多聚甲醛磷酸缓冲液经肺动脉插管灌注固定肺组织，收集组织标本。

    123 病理学观察取固定后肺组织，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片厚度为3μm，HE染色后观察病理学改变。

    124 细胞因子的检测 IL4水平的检测：按试剂盒说明进行，在抗IL4单克隆抗体包被的酶标板上，分别加入标本及不同浓度的标准品(100μl·孔-1)，室温(20～25℃)孵育120min，洗板4次，加入辣根过氧化物酶标记的抗IL4单克隆抗体(100μl·孔-1)，室温孵育60min，洗板4次，加显色剂，避光室温10～30min，加终止液，混匀，5min内用酶标仪测光密度值，绘制标准曲线，查出标本浓度。IL13水平的检测：按试剂盒说明除两次孵育改为37℃、 60min外，余同上述步骤。

    13 统计学处理

    采用SPSS 115软件，数据以x-±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间比较采用LSDt检验，相关性采用Spearman等级相关分析，P<005为差异有统计学意义。

     2 结果

    21 临床表现及病理学改变

    大鼠雾化激发后出现呼吸加快、打喷嚏、口周发绀、烦躁不安等表现，模型组有明显腹肌痉挛、点头呼吸及蜷伏；治疗组也有不同程度的类似表现,但较模型组症状要轻；正常对照组则没有出现类似表现。病理学检查示正常对照组大鼠气道上皮完整，支气管管壁未见炎性细胞浸润，平滑肌周围偶有嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润。哮喘组大鼠支气管管壁内可见明显的嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润，黏膜皱襞加深，上皮细胞脱落，支气管管腔缩小，部分管腔内有分泌物。地塞米松组、川芎嗪大剂量组、川芎嗪小剂量组及联合用药组大鼠未见管腔分泌物或小支气管痉挛，支气管管壁也可见嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润，但较模型组要少。

    22 BALF中IL4、IL13水平的变化

    6组大鼠BALF中IL4、IL13水平有显著性差异 (F=22624、 33853，均P<0001)。哮喘模型组IL4、IL13水平较正常对照组有显著性升高(P<0001)；地塞米松组、川芎嗪小剂量组、川芎嗪大剂量组及联合用药组较哮喘模型组均有显著性降低(均P<0001)，但仍比正常对照组有所升高(均P<005)。川芎嗪小剂量组、大剂量组及联合用药组IL4的降低与地塞米松组之间差异无显著性(均P>005)；川芎嗪小剂量组IL13的降低与川芎嗪大剂量组、地塞米松组之间有显著性差异(P<005)。见表1。表1 各组大鼠BALF中IL4、IL13水平

    经Spearman等级相关分析，IL4和 IL13水平呈显著正相关(r=0714，P<001)。

     3 讨论

    越来越多的研究证明Th2型细胞因子增高在哮喘发病机制中起着重要作用[1]。CD4+ Th2淋巴细胞主要产生IL4、IL5、IL9、IL13和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)等细胞因子，统称为Th2型细胞因子，其功能主要是介导体液免疫反应。许多研究证实，在哮喘患者和哮喘动物模型中，IL4和IL13 mRNA和蛋白明显增高，且与哮喘中嗜酸粒细胞增多、IgE增高、多种趋化因子和黏附分子的表达密切相关。

    IL4又称B细胞生长因子，它能促使Th0细胞向Th2型分化；刺激B细胞的增殖和分化,促进B细胞合成和分泌IgE；促进肥大细胞的生长；促进内皮细胞黏附因子Ⅰ表达；诱导淋巴细胞的黏附和嗜酸粒细胞的趋化；促进黏蛋白的基因表达和杯状细胞化生。IL13是1993年发现的，因与IL4共用受体,其在哮喘中的作用一直掩藏于后者的光辉里。IL13能刺激B细胞的增殖和分化,促进B细胞合成和分泌IgE；促进内皮细胞黏附因子Ⅰ表达；促进嗜酸粒细胞趋化因子表达[4]，从而加强对嗜酸粒细胞的趋化；激活成纤维细胞,使基质蛋白沉积失衡,从而引起呼吸道僵硬。最近发现IL13可直接使呼吸道平滑肌收缩,促进平滑肌细胞增殖,使平滑肌细胞肥大。

    本研究结果显示，与正常对照组相比，哮喘模型组BALF中IL4和IL13水平明显升高，且二者存在显著正相关，提示IL4和IL13在哮喘发病中起着重要作用。目前糖皮质激素是治疗哮喘最有效的药物。胡晓光等[5]发现哮喘大鼠血清和BALF中IL4的浓度与正常对照组相比明显增高(P<001)，地塞米松腹腔注射治疗3d后IL4水平明显降低，接近正常对照组。王玲等[6]研究证实急性发作期哮喘患者口服泼尼松治疗1周后IL13水平下降。我们也同样观察到地塞米松治疗可以使BALF中IL4、IL13水平较哮喘模型组明显降低，与文献报道相符。由实验结果可知，川芎嗪能有效降低哮喘大鼠BALF中IL4和IL13的表达水平。不同剂量川芎嗪和地塞米松对IL4表达的影响无明显差异(P>005)，大剂量川芎嗪对IL13 的影响优于小剂量(P<005)，与联合用药和地塞米松接近(P>005)，提示在哮喘的治疗中川芎嗪至少可以替代地塞米松的部分作用，同时避免地塞米松的一系列副作用。

     [参考文献]

    [1]ROMAGNANI S. Cytokiness and chemoattractants in allergic inflammation [J]. Mol Immunol, 2002， 38(1213): 881 885.

    [2]ZHOU Z, ROBERT J, ZHONDE W, et al. Pulmonary expression of interleukin13 causes inflammation, mucus hypersecretion,subepithelial fibrosis, physiologic abnormalitis, and eotaxin production[J].J Clin Invest, 1999,103(6):779788.

    [3]薛建敏, 徐永健, 张珍祥, 等.一氧化氮对致敏大鼠气道炎症及淋巴细胞功能的影响[J]. 中华结核和呼吸杂志, 1998, 21(4): 208211.

    [4]LI L, XIA Y, NGVYEN A, et al. Effects of Th2 cytokines on chemokine expression in the lung:IL13 potently induces eotaxin expression by airway epithelial cells[J]. Immunol, 1999,162(5): 24772487.

    [5]胡晓光,李昌崇,李锦燕,等. 地塞米松对哮喘大鼠Th1/Th2失衡及嗜酸细胞fas、bcl2mRNA表达的影响[J].温州医学院学报, 2004, 34(1): 1114.

    [6]王玲,张霞,薛玉文,等. 哮喘患者白细胞介素(IL) 12和IL13的变化及糖皮质激素对其的影响[J].中华内科杂志, 2003, 42(1): 2426.

    (东南大学附属中大医院儿科，江苏南京 210009)

http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2006/05/08.htm

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