半定量ＲＴ－ＰＣＲ法测定ＴＲＡＩＬ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ在胃癌组织中的表达及其意义(2)
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1.4RNA样品的提取
(1)称取从-80℃冰箱中取出解冻后的胃癌及正常胃组织各20～30mg置入匀浆器,加入1ml Trizol,室温下充分匀浆后倒入1.5ml离心管,静置5min;(2)加入0.2ml氯仿,振荡15s,室温静置5min;(3)4℃、12000g×15min离心,取上清液至另一1.5ml离心管;(4)加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min；(5)4℃、12000g×10min离心后弃上清;(6)加入1ml 4℃预冷过的75%乙醇,轻轻洗涤沉淀，4℃、7500g×5min离心,弃上清，同法再洗一遍;(7)开盖室温晾干后加入适量焦碳酸二乙酯水溶解(可65℃促溶15min)。如暂不做RT-PCR可先于-80℃冰箱保存。
1.5RT-PCR实验
取焦碳酸二乙酯处理过的0.5ml离心管，每管加入10×Reaction Buffer 5μl，50mmol·L-1 MgCL21.5μl,10mmol·L-1的dNTP 1μl，RNA抑制剂1μl，10pmol·L-1的上下游引物各1μl，5U·μL-1的逆转录酶1μl，1U·μL-1的Taq酶2μl以及模板RNA 1μg,最终加焦碳酸二乙酯水至50μl ......
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