高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究(2)
参见附件(459kb)。
Key words:vascular smooth muscle cell；phosphate；calcification；osteocalcin；phosphonoformic acid
(Modern Medical Journal,2008,36:73-77)
终末期肾病(ESRD)接受长期肾替代治疗的患者越来越多，这些患者的一个严重问题是血管病变，包括缺血性心脏病、脑血管病变和动脉粥样硬化，是其主要的死因。ESRD患者(即使是年轻的患者)常存在血管钙化，与病死率呈正相关[1]。肾病特别是ESRD患者常存在高磷血症。近来高磷血症被认为是引起血管钙化和心血管病变死亡的主要危险因素之一[2]。Kestenbaum等[3]研究发现，高磷血症是导致ESRD患者病死率和心肌梗死发生率升高的危险因素，且独立于肾功能和其他已知危险因素。研究高磷血症致血管钙化的机制及防治措施具有重要的临床意义。本实验观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响，初步探讨高磷血症促进血管钙化的可能机制；同时观察膦甲酸钠(phosphonoformic acid，PFA)对高磷诱导该细胞钙化的干预作用，从而为防治ESRD患者血管钙化提供新的理论观点。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
健康新生小牛胸主动脉由南京血清厂提供，胎牛血清为上海浦东开发区高桥兽医站产品，DMEM、胰蛋白酶为Gibco公司产品，钙测定试剂盒为Sigma公司产品，BCA蛋白测定试剂为上海吉泰生物技术公司产品，骨钙素放射免疫分析试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，RT-PCR试剂盒为大连宝生物有限公司产品，膦甲酸钠由江苏天晴制药厂提供。细胞培养箱(Queue公司产品， Q2711型)，YJ-875医用净化工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂，XSZ-D型)，高速、低温离心机(Heeraeus,D-37520型)，PCR仪(GeneAmp PCR-system 9600)，电泳仪(LKB BROMMOL/LA 2197 power supply)，UVP凝胶密度扫描仪(美国 Gene公司)。
1.2 牛主动脉平滑肌细胞(VSMC)的培养
采用贴壁法原代培养。无菌条件下迅速取出健康新生小牛胸主动脉，置于无菌培养皿中，用D-Hanks液洗净，剥离血管外结缔组织；以眼科剪纵行剖开，小心剥离血管外膜和内膜，然后用眼科剪将血管中膜剪成1mm3大小，接种于100ml培养瓶中，置37℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养3～4h，待其贴壁后加入含有15%胎牛血清、100U•ml-1青霉素、100μg•ml-1链霉素的DMEM培养液约4ml，静置于37℃、体积分数为5%CO2孵箱中继续培养。每周换液2次。一般在接种后7～10d可见平滑肌细胞由组织边缘爬出，光镜下细胞呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。待VSMC生长融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化、传代培养。
5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板，细胞融合后换用正常磷(Pi 1.5mmol•L-1)、高磷(2.0mmol•L-1)培养基培养10d,2组培养基中钙离子浓度为1.8mmol•L-1。同时用Pi1.5mmol•L-1、Pi2.0mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0.25、0.5、1.0mmol•L-1)培养基培养3d,所有培养基中钙离子浓度均为1.8mmol•L-1。换用培养基的第1天定为0天。
1.3 钙沉积定量
培养不同天数的细胞用D-Hanks液洗涤3次后，0.6mol•L-1盐酸脱钙24h。盐酸悬液中钙含量用甲O-酚酞络合酮方法测定。脱钙后的细胞用D-Hanks液洗涤3次，0.1mol•L-1NaOH/0.1%SDS溶解细胞，BCA(Bicinchoninic acid)法测定蛋白含量。用蛋白含量标化钙含量。
1.4 骨钙素测定及RT-PCR
第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板及培养瓶，细胞汇合后换用不同磷浓度的培养基:Pi 1.5、Pi2.0、Pi2.5mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0 ......
Key words:vascular smooth muscle cell；phosphate；calcification；osteocalcin；phosphonoformic acid
(Modern Medical Journal,2008,36:73-77)
终末期肾病(ESRD)接受长期肾替代治疗的患者越来越多，这些患者的一个严重问题是血管病变，包括缺血性心脏病、脑血管病变和动脉粥样硬化，是其主要的死因。ESRD患者(即使是年轻的患者)常存在血管钙化，与病死率呈正相关[1]。肾病特别是ESRD患者常存在高磷血症。近来高磷血症被认为是引起血管钙化和心血管病变死亡的主要危险因素之一[2]。Kestenbaum等[3]研究发现，高磷血症是导致ESRD患者病死率和心肌梗死发生率升高的危险因素，且独立于肾功能和其他已知危险因素。研究高磷血症致血管钙化的机制及防治措施具有重要的临床意义。本实验观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响，初步探讨高磷血症促进血管钙化的可能机制；同时观察膦甲酸钠(phosphonoformic acid，PFA)对高磷诱导该细胞钙化的干预作用，从而为防治ESRD患者血管钙化提供新的理论观点。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
健康新生小牛胸主动脉由南京血清厂提供，胎牛血清为上海浦东开发区高桥兽医站产品，DMEM、胰蛋白酶为Gibco公司产品，钙测定试剂盒为Sigma公司产品，BCA蛋白测定试剂为上海吉泰生物技术公司产品，骨钙素放射免疫分析试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，RT-PCR试剂盒为大连宝生物有限公司产品，膦甲酸钠由江苏天晴制药厂提供。细胞培养箱(Queue公司产品， Q2711型)，YJ-875医用净化工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂，XSZ-D型)，高速、低温离心机(Heeraeus,D-37520型)，PCR仪(GeneAmp PCR-system 9600)，电泳仪(LKB BROMMOL/LA 2197 power supply)，UVP凝胶密度扫描仪(美国 Gene公司)。
1.2 牛主动脉平滑肌细胞(VSMC)的培养
采用贴壁法原代培养。无菌条件下迅速取出健康新生小牛胸主动脉，置于无菌培养皿中，用D-Hanks液洗净，剥离血管外结缔组织；以眼科剪纵行剖开，小心剥离血管外膜和内膜，然后用眼科剪将血管中膜剪成1mm3大小，接种于100ml培养瓶中，置37℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养3～4h，待其贴壁后加入含有15%胎牛血清、100U•ml-1青霉素、100μg•ml-1链霉素的DMEM培养液约4ml，静置于37℃、体积分数为5%CO2孵箱中继续培养。每周换液2次。一般在接种后7～10d可见平滑肌细胞由组织边缘爬出，光镜下细胞呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。待VSMC生长融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化、传代培养。
5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板，细胞融合后换用正常磷(Pi 1.5mmol•L-1)、高磷(2.0mmol•L-1)培养基培养10d,2组培养基中钙离子浓度为1.8mmol•L-1。同时用Pi1.5mmol•L-1、Pi2.0mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0.25、0.5、1.0mmol•L-1)培养基培养3d,所有培养基中钙离子浓度均为1.8mmol•L-1。换用培养基的第1天定为0天。
1.3 钙沉积定量
培养不同天数的细胞用D-Hanks液洗涤3次后，0.6mol•L-1盐酸脱钙24h。盐酸悬液中钙含量用甲O-酚酞络合酮方法测定。脱钙后的细胞用D-Hanks液洗涤3次，0.1mol•L-1NaOH/0.1%SDS溶解细胞，BCA(Bicinchoninic acid)法测定蛋白含量。用蛋白含量标化钙含量。
1.4 骨钙素测定及RT-PCR
第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板及培养瓶，细胞汇合后换用不同磷浓度的培养基:Pi 1.5、Pi2.0、Pi2.5mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0 ......
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