神经营养因子-3 mRNA及其受体TrkC mRNA在大鼠变应性鼻炎鼻黏膜中的表达(1)
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[摘要]目的 探讨神经营养因子-3 mRNA(neurotrophin-3 mRNA,NT-3 mRNA)及其受体酪氨酸蛋白激酶受体C mRNA(tyosine kinase C mRNA,TrkC mRNA)在变应性鼻炎鼻黏膜中的表达情况。方法 将出生6～8周健康SD大鼠30只随机分成实验组20只和对照组10只,实验组以卵清蛋白致敏激发制成大鼠变应性鼻炎模型,采用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcriptive polymerase chain reaction,RT-PCR)对20例实验组大鼠鼻黏膜中NT-3 mRNA和TrkC mRNA的表达情况进行检测,并与对照组大鼠进行比较。结果 实验组NT-3/β-Actin(内参照)为2.968±0.828,对照组为0.267±0.127,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);实验组的TrkC/β-Actin(内参照)为9.708±2.717,对照组为1.146±0.424,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。NT-3 mRNA与TrkC mRNA的表达呈正相关(r=0.67,P<0.01)。结论 神经营养因子-3及其受体TrkC与大鼠变应性鼻炎的发生有着密切关系。
[关键词]大鼠变应性鼻炎;神经营养因子-3;酪氨酸蛋白激酶受体C;逆转录-多聚酶链反应
[中图分类号] R765.21;Q786
[文献标识码] B
[文章编号]1671-7562(2009) 04-0294-03
神经营养因子(NF)是对神经系统有特异性作用的一类蛋白质,可促进神经元的分化、存活、突起生长、突触形成以及细胞迁移和增殖。研究[1]表明,神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸蛋白激酶受体A/B(TrkA/B)在变应性鼻炎患者的上、下呼吸道黏膜中的表达较正常人高。因此我们应用RT-PCR法检测NT-3 mRNA和TrkC mRNA在大鼠变应性鼻炎鼻黏膜中的表达情况,以进一步探讨其在大鼠变应性鼻炎发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 建立大鼠变应性鼻炎模型
1.1.1 实验动物 由东南大学动物实验中心提供,出生6～8周健康SD大鼠30只,雌雄不限,体重170～220 g,随机分为实验组(20只)和对照组(10只)。
1.1.2 致敏方法 实验组大鼠以卵清蛋白(Sigma公司产品,美国)0.3 mg作为抗原,氢氧化铝30 mg作佐剂,加生理盐水1 ml制成混悬液,腹腔内注射,隔日1次,共7次。腹腔注射免疫完成后,每侧鼻腔均以5%卵清蛋白10 μl局部免疫,每日1次,共7次。对照组动物以生理盐水代替卵清蛋白,其余方法和步骤不变。
1.1.3 评分标准 于末次鼻腔致敏后,立即观察30 min,观察大鼠抓鼻、喷嚏、鼻溢的情况。评分标准:(1)鼻痒。轻度搔抓鼻1~5次为1分,中度搔抓鼻6~15次为2分,剧烈搔抓鼻15次以上为3分。(2)喷嚏。1~3个为1分,4~10个为2分,11个以上为3分。(3)清涕。流至鼻孔为1分,超出前鼻孔为2分,涕流满面为3分。以上各项指标均采用叠加量化记分法,总分>5分表示造模成功[2-3]。
1.2 方法
以1%戊巴比妥(40 mg•kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,断头,鼻背正中切开,迅速取出鼻中隔和鼻腔外侧壁黏膜。标本在PBS中漂洗后立即置于液氮中冷冻保存。实验时迅速取液氮冻存的组织置于预先用液氮预冷的碾钵中,按Trizol试剂说明书步骤抽提组织总RNA。
-CAGTGAGGCCAGGATAGAGC-3′为β-Actin(内参照)引物(611 bp),加入PCR反应试剂,构成50 μl反应体系,置于0.5 ml薄壁Eppendorf管中,置入瞬时离心机中离心10 s,上机进行PCR扩增。NT-3的PCR反应条件为:94 ℃变性5 min,执行第一个循环,条件为94 ℃变性30 s,45 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,6个循环;第二循环为94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,22个循环;最后延伸10 min,4 ℃终止反应。β-Actin的PCR的反应条件为:94 ℃变性5 min,执行第一个循环,条件为94 ℃变性30 s,45 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,6个循环;第二循环为94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,20个循环;最后延伸10 min,4 ℃终止反应。
取RT-PCR产物5 μl直接加样于1%琼脂糖凝胶孔中,以DNA 2000为Maker,120 V水平电泳30 min,紫外透射仪下观察结果。273 bp及611 bp处出现条带为阳性。
将电泳后的凝胶置于Gel Doc 1000凝胶成像系统内,设置好焦距后照相,在Quantity One软件分析下,测得NT-3和β-Actin的灰度值,将NT-3产物条带的灰度值与β-Actin产物条带的灰度值相比(NT-3/β-Actin),即得NT-3表达的相对值。
与上同法,以P1:5′-CAAGCCCACCCACTACA
AC-3′及P2:5′-ACCACCAGAAGGACGCAG-3′为TrkC引物(246 bp),以P3:5′-GTCGTACCACTGG
CATTGTG-3′及P4:5′-CAGTGAGGCCAGGATAG
AGC-3′为β-Actin(内参照)引物(611 bp),得到TrkC表达的相对值。
1.3统计学处理
采用SPSS 11.0统计软件进行分析。所有计量资料均采用x-±s表示,组间均数比较时先进行正态性检验和方差齐性检验。检验结果成正态分布,且方差齐,故采用t检验。
2 结果
以β-Actin为内参照,检测20只大鼠变应性鼻炎鼻黏膜和10例正常鼻黏膜中的NT-3 mRNA和TrkC mRNA的表达情况,其 RT-PCR结果如下(图1、2)。
经图像分析仪测量计算后,NT-3/β-Actin实验组为2 ......
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