不同时间血液灌流对脓毒症兔血IL-6及TNF-α水平的影响(2)
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1.2 方法
1.2.1 动物模型制备
参照文献[4]的兔盲肠结扎穿孔法(CLP)制备兔脓毒症模型。自耳缘静脉注入1.5%戊巴比妥钠溶液2 ml•kg-1。腹正中线切开约7 cm,打开腹腔,在阑尾和盲肠交界处用丝线结扎,并将阑尾血管结扎。用直径2.5 mm针头,对穿阑尾3次。检查无活动出血点后回纳盲肠,缝合腹壁。术后维持麻醉状态并继续进行股动静脉置管术。
1.2.2 股动静脉置管
触及右腹股沟动脉波动最明显处后,沿腹股沟切开皮肤约3.5 cm,暴露并分离股动、静脉约3 cm,下穿双丝线。股动脉近心端予动脉夹夹闭后,持预先充满肝素的医用留置针自远心端插入动脉,退针芯,松开动脉夹。结扎及固定动脉前,于动脉和丝线间放入橡胶小软垫(用橡胶手套边缘剪出约1 cm做成,术前碘伏消毒)以防止结扎后右下肢缺血性坏死。股静脉穿刺方法同样。缝合皮肤,盖纱布,外露肝素帽及部分导管,以待行血液灌流用。留置针定时用肝素冲管。
1.2.3 分组
把18只实验兔随机分为6组,每只均按上述依次行盲肠结扎穿孔术(CLP)及动静脉置管,每组3只。6组分别为手术后3 h灌流组(术后3 h组,即盲肠结扎穿孔手术腹壁肌层缝合完毕开始算起3 h后行单次血液灌流,以下分组类似)、术后6 h组、术后12 h组、术后24 h组、术后48 h组及空灌流组(即对照组或空灌组,术后3 h仅行空灌流,灌流器内无吸附剂,仅以肝素生理盐水充满)。每组均按所在组对应术后时间行血液灌流。
1.2.4 血液灌流
兔灌流罐用20 ml注射器制作,内含HA330灌流罐湿树脂15 ml。对照组空灌流器注射器内不含树脂。管路连接为：输血器针头(插入股动脉端留置针肝素帽)→输血器软管35 cm→自制注射器灌流器→输血器软管10 cm→兰格16号软管15 cm→输血器软管15 cm→输血器针头(插入股静脉端肝素帽)。灌流前均已行钴-60辐照消毒,剂量20 KGy。用肝素盐水[含肝素30 mg•(250 ml)-1]预冲管路并在灌流前10 min静脉推注肝素8 mg•kg-1,达肝素化。灌流时间2 h,速度为5 ml•min-1。
1.2.5 观察和检测指标、采集时间
1.2.5.1 观察指标 术后兔均固定于手术台上直至死亡。手术间温度控制在25 ℃左右,每日补充液体量按70 ml•kg-1(生理盐水 ∶10%葡萄糖注射液为1 ∶3),由耳缘静脉或股静脉留置针缓慢滴入,但采血前或灌流前0.5 h暂停补液,以免影响结果。如果兔醒后骚动较剧烈可于静脉端留置针酌情缓慢滴入少量戊巴比妥钠镇静。每日定时观察兔体温、心率、呼吸、精神状态,并记录生存时间(起点为做完CLP时间,终点为兔死亡时间)。
1.2.5.2 检测指标、采集时间 各实验兔均于盲肠结扎穿孔手术前、术后3 h、术后6 h、术后9 h、术后12 h、术后24 h、术后48 h一共7个时间点经过兔耳缘静脉采血,每次2 ml。均通过ELISA法试剂盒集中检测IL-6及TNF-α水平。
每只兔均于术前及术后24 h分别行外周血白细胞计数；并在术后24 h无菌操作下采集静脉血1 ml,注入牛肉汤中37 ℃孵箱中增菌,牛肉汤浑浊后转血平皿,长出单个菌落后进行细菌鉴定。手术前后白细胞计数有明显升高或降低、血培养有致病菌生长的实验兔方可认为脓毒症造模有效；若否,则均需重新再随机抽取实验兔重复实验至造模成功为止。
1.3 统计学处理
计量资料以±s表示,采用统计学软件SPSS 13.0,检验水准α=0.05。生存时间用生存分析Kaplan-Meier法。IL-6及TNF-α水平均用重复测量方差分析,并行两者相关性分析。
2 结 果
2.1 生存结果
结扎穿孔术后约24 h兔开始出现精神倦怠，呼吸、心率逐渐增快等症状,均于术后48 h至80 h间死亡。手术前后白细胞计数均有明显变化,血细菌培养结果均有大肠杆菌生长。3 h组生存时间为(49.333±0.882)h；6 h组为(51.333±1.856)h；12 h组为(73.333±3.528)h；24 h组为(64.667±4.667)h；48 h组为(58.000±3.055)h；空灌流组为(50.667±1.202)h。总体间差异有统计学意义(P=0.001);3 h组与12 h组、24 h组、48 h组,6 h组与12 h组、24 h组,12 h组与48 h组、空灌流组,24 h组与空灌流组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05),余各组间无差异,以12 h组生存时间最长。
2.2 TNF-α质量浓度
结果见表1。
经检验,总体存在差异(P=0.020)，重复时间测量与分组间无交互作用(P=0.190),故只分析主效应。主效应：重复因素7个不同时间点间差异有统计学意义(P=0.000),其中6 h测量点TNF-α浓度最高。不同灌流组间差异有统计学意义,P=0.020；各灌流组间两两比较(LDS法),3 h组与空灌流组、24 h组、48 h组差异有统计学意义(均P<0.05),余各组间无差异，以3 h组TNF-α平均浓度最低。
2.3 IL-6质量浓度
结果见表2。
经检验,总体存在差异(P=0.044),重复时间测量与分组间无交互作用(P=0.700),故只分析主效应。主效应：重复因素7个不同时间点间有统计学差异(P=0.000),其中12 h测量点IL-6浓度最高。不同灌流组间有统计学差异(P=0.044)；各灌流组间两两比较(LDS法),空灌流组与6 h组、12 h组、24 h组,48 h组与6 h组、12 h组、24 h组相比较差异有统计学意义(均P<0.05),余各组间无差异,以12h组IL-6平均浓度最低。
2.4 IL-6及TNF-α相关性分析
IL-6及TNF-α经正态性检验,不符合正态分布,故采用Spearman秩相关分析。结果显示，P=0.838,r=0.018,说明IL-6及TNF-α无直线相关关系 ......
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