多肽：Ｎ—乙酰氨基半乳糖转移酶2的核表达、纯化及酶活检测
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[摘 要] 目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21，中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppCalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体PCEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖(IPrG)诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2，ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。
[关键词]多肽；N-乙酰氨基半乳糖转移酶2；原核表达；原核表达；GST融合蛋白；谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析；酶活检测
[中图分类号]Q53；R34
[文献标识码]A
[文章编号]1671-7783(2006)02-0093-04
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