嗅鞘细胞移植在修复损伤脊髓中的作用
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[关键词] 嗅鞘细胞; 移植; 脊髓损伤
一般认为,中枢神经系统损伤后其再生、修复和功能恢复是绝对不可能的,脊髓损伤一直是全世界医疗界最棘手的问题。1981年神经学家在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经结构修复是可能的,掀起了各国学者对脊髓修复研究的又一次热潮,其中关于细胞移植的研究开展得尤有成效。早在1973年,科学家就发现人类的鼻黏膜每周就要新陈代谢一次,这引起了很多致力于脊髓损伤修复研究的机构和学者的兴趣。成人嗅黏膜上皮是终生不断神经化的单位,产生新神经的干细胞来源目前尚未清楚,但被认为是一种嗅上皮的基本细胞,而嗅黏膜上皮的这种再生能力则要归功于嗅神经特有的胶质细胞——嗅鞘细胞(Olfactory Ensheathing Cell,OECs)。三十多年来,关于嗅鞘细胞的研究和调查一直在进行中,逐渐地,嗅鞘细胞已成为目前用于脊髓修复最有效和最有前景的移植物。
1 嗅鞘细胞的特性
11 嗅鞘细胞的解剖学特性
嗅鞘细胞是嗅神经系统中的一种特有的胶质细胞,分布在嗅神经，嗅球的第一、二层和嗅上皮。它包绕于嗅神经轴突,伴随它们从鼻走行到大脑,并在那里形成突触和嗅球的帽状细胞。嗅神经在中枢神经系统中有一个特性,就是它能不断地新陈代谢,被嗅上皮基底干细胞层新生的神经元所代替,继而新生神经元的轴突在鼻和脑之间重新建立联系,这样的过程每30~60天就能完成,并不断重复循环[1]。嗅鞘细胞就存在于从嗅神经上皮到嗅球神经纤维层的过渡区,也是中枢神经系统和外周神经系统(CNSPNS)的边界,也就是说,它存在并迁徙于周围神经和中枢神经之间,可以穿越两者之间的屏障。在这样的环境中,它能使轴突成鞘,并在其前方迁移从而引导轴突生长,最终形成突触;同时它还分泌多种神经营养因子帮助新生轴突生长。嗅鞘细胞在嗅神经再生过程中的促进作用为中枢神经系统的再生修复提供了希望。
12 嗅鞘细胞的化学特性
尽管嗅鞘细胞使嗅神经不断更新的分子机制尚未清楚,但关于它们的免疫细胞化学研究为我们对他们的生理性能的了解提供了帮助。嗅鞘细胞免疫细胞化学分型十分复杂,在不同的物种、年龄和环境中都不断改变,目前研究最多的有以下两种:①类神经膜细胞型,主要存在于外周嗅神经系统内,呈纺锤形, 表达p75受体,这些细胞主要负责轴突的重新髓鞘化和促进轴突生长。 ②类星形胶质细胞型,主要存在于嗅球内,形态扁平,缺乏p75受体,这些细胞表达胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),形成血管的连接,产生嗅神经系统的胶质界膜。 由此我们可以看出嗅鞘细胞确实是一种独特的胶质细胞,因为它拥有神经膜细胞和星形胶质细胞两种细胞的特性。实验表明,嗅鞘细胞能表达一些促进神经生长和突起的因子[2],包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor,BNGF)、血小板衍化生长因子(plateletderived growth factor,PDGF)、胶质细胞源性神经生长因子(gliaderived neurotrophic factor,GDNF)、神经营养因子(neurotrophin, NT3、NT4 、NT5)、神经肽(neuropeptide Y,NPY)、S100等;同时,嗅鞘细胞还能表达参与这些细胞粘附和促进轴突生长的支持因子,如层粘连蛋白(laminin)、L1、纤维连接蛋白(fibronectin)、胶质源性连接素(gliaderived nexin),含唾液酸的神经粘附分子(polysialylated neural cell adhesion molecule,BSANCAM)和神经细胞粘附分子(neural cell adhesionmolecule,NCAM)。这两类分子能在脊髓损伤修复过程中起到促进、帮助作用,除此之外,还有一些抗体在研究嗅鞘细胞特性时被应用,如生长相关蛋白(growth associated protein,GAP43)、O4、葡萄糖脑苷脂(glucocerbroside,GC)、抗人自然杀伤细胞标志单抗(HNK1)、E18等,它们主要被用来标志不同时期的嗅鞘细胞,在观察和分离提纯嗅鞘细胞中起作用。另一方面,有实验表明嗅鞘细胞在被移植入脊髓后有和星形胶质细胞结合的趋向,因此它还能像星形胶质细胞一样存在于中枢神经系统,更重要的是,它不引起星形胶质细胞的增生和表达硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPN)的上调,减少星形胶质细胞的反应性增生和蛋白多糖的表达,从而更能促进电位的恢复。这两种特殊属性的结合是嗅鞘细胞成为脊髓修复的热选。
13 嗅鞘细胞的生物学功能
嗅鞘细胞在促进神经再生和生长的过程中有着复杂而独特的功能。首先,在损伤时神经纤维周围的一些胶质细胞能够产生一些抑制轴突再生因素如生长抑制蛋白等,嗅鞘细胞独特的成鞘作用可以使受伤神经纤维和周围胶质细胞微环境隔绝,从而有效保护新生轴突并为其生长提供适宜的微环境。在这样的环境中,嗅鞘细胞能分泌多种神经营养因子,为损伤神经修复、再生以及功能恢复提供更好的条件[3]。除此之外,嗅鞘细胞能与周围的星形胶质细胞和小胶质细胞表达的远肌球蛋白激酶受体(TrkA、TrkB、TrkC)结合,诱导他们分泌大量的胶质源性神经生长因子并抑制其反应性增生,从而抑制损伤后的胶质瘢痕形成,进一步为神经轴突再生和生长提供良好的微环境。嗅鞘细胞的另一个重要的特性就是它能伴随新生的轴突迁移入周围神经系统和中枢神经系统,即使是受伤和瘢痕组织也能穿过,同时,实验证实,这样的特性在被移植入脊髓后仍然存在,这为用嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤提供了更进一步的可能。
14 嗅鞘细胞的来源
嗅鞘细胞的独特性质很可能改变人们认为中枢神经不可再生、修复的传统观念,在修复脊髓损伤中发挥关键作用。目前,对于如何分离、培养、纯化嗅鞘细胞有很多方法。最初的来源是新生儿的嗅球,后来也可以来源于尸体、脑外伤病人、猪等,但现在发现可以从自体嗅黏膜或嗅球直接取材,一般不会影响嗅觉,这是一个便捷而充足的来源,而且不涉及伦理道德问题。由于嗅鞘细胞和神经膜细胞一样可以表达低效能的神经生长因子受体p75NRT,这使它能从嗅球中与星形胶质细胞免疫分离出来,这是目前最常用的获得嗅鞘细胞启动量的方法。除此之外还有一些方法,如O4差速贴壁法。而在嗅黏膜固有层中则有着一定数量的神经膜细胞和嗅鞘细胞结合,在免疫纯化中有着更复杂的过程:先使用O4差速贴壁法,然后在含有神经营养药的血清媒介中培养,嗅鞘细胞表达NGF和BDNF，还有一些高效能的神经营养药受体TrKA、TrKB和TrKC,其中TrKC的协合物NT3是刺激嗅鞘细胞增殖和存活效力最强的,在含有这种神经营养药的血清媒介中,只允许嗅鞘细胞在几周内快速增殖。几周后,这样的血清中不再含有一种由神经膜细胞表达而嗅鞘细胞却不能表达的分子HNK1,嗅鞘细胞得到纯化。这种方法使自体嗅鞘细胞能够在移植应用时有足够的数量,解决了免疫抑制和免疫排斥的问题,在使用自体细胞用于人体试验方面具有里程碑意义。
2 嗅鞘细胞在动物脊髓修复实验中的作用
嗅鞘细胞的以上几项特殊的性质提示了它在脊髓修复中将可能有着令人惊喜的作用,事实上,越来越多的证据表明嗅鞘细胞移植确实能在多种脊髓损伤修复实验中促进轴突再生和一定程度的功能恢复。在成年鼠的不同类型的脊髓损伤模型中,几乎所有研究嗅鞘细胞的小组都已经认识到了这种细胞的治疗潜力。回顾一下研究嗅鞘细胞功能的各种实验方法和过程,可以分为创伤性损伤模型、脱髓鞘模型、电化学损伤模型。
21 嗅鞘细胞移植修复CNS的创伤性损伤
1994年RamonCueto的成年鼠脊神经根切断术是第一个测试嗅鞘细胞促进损伤轴突再生能力的实验。在这个研究中,T8水平的脊神经根在进入脊髓处被切断,然后又在显微外科手术中被接回同样的位置。紧接着,将从成年鼠嗅球中取得并经过免疫纯化的p75OECs悬浊液通过细玻璃针注入脊神经根入口处的脊髓。3周后,脊神经根被发现穿越了PNSCNS屏障,重新长入了脊髓并到达了正常条件下所受神经支配的大部分脊髓层面;另有一个非凡的发现就是OECs源自植入单位的迁徙能力,这些细胞在生长的神经纤维相同区域被探查到。5年后,Navarro等人在腰部神经根切断术实验中也得出了同样的结果。还有其他更多的类似实验证实了移植OECs的鼠再生的外周神经能够恢复反射活动和膀胱功能[4]。
而对于临床应用更有意义的是,OECs在脊髓全横断模型中也表现出了作用。1998年RamonCueto的实验中,一个脊髓胸节段被完全切除,成年鼠嗅球p75OECs联合神经膜细胞一起移植。OECs被注入两侧脊髓残端中线处的四个点,而PAN/PVC的神经膜细胞引导物被用于桥接两侧残端。在这个实验中,OECs能促进受损的上行和下行纤维束远距离延伸,并从注入点迁徙。因此可以看出,即使在严重的脊髓损伤中,OECs仍然有着在主体CNS环境中迁徙和促进纤维束生长的能力。这些再生的轴突不是长入神经膜细胞移植体,而是在被OECs和其他一些连接组织包绕形成的微环境中生长。这个发现至少可以表明,在悬浊液中,神经膜细胞不是对生长起决定作用的底物。在接下来的一些实验中[5],发现OECs能促进远距离轴突再生,并能穿越胶质瘢痕,到达脊髓头尾两端末梢,长入正常条件下所受神经支配的节段。移植OECs后,四肢瘫痪的鼠能够自发地活动后肢,适当地放置爪子来支撑身体的重量。它们还获得了轻微的触觉和本体感觉。这些实验表明OECs不仅对选择性脊髓片状损伤的修复有促进作用,对完全的脊髓横断同样有此效果。此后的更多研究也都确认了这点。
同时,在脊髓半横断[6，8~11]、挫裂伤[7]等实验模型的研究领域,不少学者和小组也做出了探索,他们同样发现OECs具有促进轴突生长和促进功能恢复方面的作用,并进一步解释了OECs怎样使轴突延伸、髓鞘化和恢复神经冲动传导等。另外,嗅上皮固有层也被用于移植[12、13],但发现功能改善方面效果不如嗅球OECs移植好。移植嗅球OECs的鼠能够获得后肢的协调运动以支撑身体的重量,但移植同样来源嗅上皮固有层片状组织的鼠只能活动后肢但不能支撑身体重量。产生这种差异的原因是不同胶质细胞和中枢神经细胞之间的相互作用[14、15],在移植嗅上皮固有层组织后经历更长时间后也可能获得同样的功能恢复。但也存在另一种观点,认为这些不同的胶质细胞在一定条件下对OECs有辅助促进作用,所以移植以OECs为主的多种混合细胞乃至组织块,可能都比移植纯化OECs更好[16]。
在证实了嗅鞘细胞对脊髓修复的确切作用后,一些与移植技术相关的研究也在开展。在脊髓损伤4周后OECs的延迟移植仍具有促进修复的功能[13]。这个发现表明嗅鞘细胞的人体治疗能够被推迟到病人度过急性期,在病情稳定后再进行。还有一些关于嗅鞘细胞移植受体年龄的的影响也有报道。
22 嗅鞘细胞在脱髓鞘损伤中的应用
目前脱髓鞘病变的治疗已经成为一项艰巨的临床挑战,嗅鞘细胞移植也被用于这方面的实验室研究,并成为颇有前景的一种方法。Franklin等人在1996年首次展示了在鼠的脱髓鞘损伤模型中,嗅鞘细胞移植能够使脱髓鞘的脊髓轴突重新髓鞘化。接下来的许多实验室都证实了这一点,从而掀开了人类脱髓鞘病变治疗方法新的篇章。一般认为,嗅鞘细胞并不在小直径的嗅神经轴突外成鞘,但遇到较大直径的轴突能呈现出使之髓鞘化的亚型,这种OECs在形态学、亚显微结构、生化等方面都和神经膜细胞类似[17]。最近发现,脑室膜细胞等其他类型的胶质细胞在混合OECs移植后能加速神经髓鞘化的速度[18、19],其中的机制尚不明确,可能涉及胶质细胞之间的相互作用。另外,在像多发性硬化症这样的脱髓鞘病变中,OECs移植进入含有星形胶质细胞的损伤区域后所表现出来它们的潜在作用，比神经膜细胞具有优势,从而也使人们对它的特性有了更好的了解并更有效地加以利用。
23 嗅鞘细胞在脊髓特定区域电解质溶液损伤、光化学损伤修复中的应用
除了在脊髓创伤性和脱髓鞘损伤修复中有着巨大作用外,人们还期望嗅鞘细胞能应用于修复其他类型的脊髓损伤。再次令人欣喜的是,在脊髓电解质溶液损伤模型中[20，21],一定条件下的嗅鞘细胞移植同样能促使脊髓皮质束纤维髓鞘化并穿越损伤区域,改善成年鼠前肢运动的功能;在脊髓光化学损伤模型中[21],实验室条件下的嗅鞘细胞在移植后能在损伤区域起到神经保护、抑制空洞形成和反应性胶质细胞增生的作用,更有利于脊髓修复。
3 嗅鞘细胞移植应用于脊髓修复的现状和展望
经过多年对OECs的研究,人们认识到OECs移植已经成为人类脊髓修复最有前景的一项技术。目前,国内外很多相关嗅鞘细胞移植的工作已经开始从动物实验走向临床研究和应用。我国黄红云教授等[22]对23例脊髓损伤晚期患者进行了OECs移植治疗,结果患者都得到了一定的脊髓功能改善,但移植的安全性和远期负面结果仍无法估计。还有很多涉及OECs移植的具体问题需要解决和优化,如外科手术方法、移植体的选择、移植过程的安全性,联合移植问题也有待进一步探索。OECs移植最终发展成为解决脊髓修复难题的利器仍然是一项艰苦漫长但又充满希望的过程。
(感谢南京医科大学附属常州市第二人民医院普外科李圆医师的指导)
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(常州市第二人民医院骨三科, 江苏 常州 213003)
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