神经干细胞经脑室移植后在损伤脊髓的早期动态分布
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摘要：目的 观察神经干细胞经脑室移植后在损伤脊髓的早期动态分布。方法 取转录有绿色荧光蛋白(GFP)基因的孕16d SD鼠胚脑海马组织，培养成神经干细胞球，注射到脊髓损伤鼠第四脑室，通过免疫染色和电镜，观察其在脊髓的存活、分化状况。结果 移植细胞在脊髓表面形成细胞团，大多分布于损伤区头侧的腹、背侧两面。细胞团面积背侧小于腹侧；数目背侧多于腹侧，并于术后5d达到高峰。这种分布和增殖形式见于损伤脊髓正常部分和无损伤脊髓(对照组)。1周时细胞侵入损伤区，分化并表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。2～3周时与宿主细胞良好融合。结论 通过脑脊液移植细胞对于损伤性脊髓进行干细胞移植是一种实用、有效的方法。
关键词：神经干细胞；移植；脊髓损伤；第四脑室；脑脊液
Early and dynamic distribution of the stem cells on the injured spinal cord
following transplantation through the fourth ventricle
Bai Hongliang, Wu Sufan, Suzuki Y
(1. Plastic, Laser & Cosmetic Center, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061;2. Plastic Department, Zhejiang Provincial Hospital, Hangzhou 310014, China; 3. Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kyoto University Graduate
School of Medicine, Kyoto 606-8507, Japan)
ABSTRACT: Objective To observe the distribution of hippocampusderived neural stem cells on the spinal cord surface following injection through the 4th ventricle. Methods Cultured from hippocampal tissues of E16 fetuses with GFP genes, the stem cells were transplanted into cerebrospinal fluid (CSF) in the injured spinal cord through the 4th ventricle. Distribution and differentiation of the stem cells were observed by immunostain and electromicroscopy. Results The transplanted cells formed tiny spots on the pia mater of the spinal cord and proliferated into large cellclusters. Most of them distributed on the cranial side of the injured area. Usually, the size of the clusters is smaller on the dorsal aspect than on the ventral aspect, the number of clusters is larger on the dorsal side than that on the ventral side. The cell clusters increased rapidly up to 5 days after injection. The number of clusters tended grow larger on the dorsal side than on the ventral side. These patterns of cell dissemination and proliferation were found on intact spinal cord, as well as at the normal part of the contusioninjured spinal cord (control). At the injured site, the cells migrated into the lesion and expressed GFAP immunoreactivity 1 week after injection. 2～3 weeks after transplantation, they can migrate and be integrated into the injured spinal cord. Conclusion Transplantation of the neural stem cells through the ventricle into the injured spinal cord is a unique method to disseminate cells all over the spinal cord, and these cells can migrate and be integated into the injured spinal cord.
KEY WORDS: neural stem cell; transplantation; spinal cord injury (SCI); fourth ventricle; cerebrospinal fluid (CSF)
目前，应用神经干细胞移植技术治疗中枢神经系统损伤的研究已相当广泛，移植途径也各不相同，如局部注射、载体运载\[1,2\]等。脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)途径给药也早已为临床医生所认知，近几年来又有学者通过脑脊液应用基因药物\[3\]、神经营养因子\[4\] 等治疗中枢神经系统的损伤和病变。受此启发，我们将体外培养的神经干细胞通过脑室注射进入脑脊液，实现了移植细胞在宿主损伤脊髓区周围的贴附和聚集，部分细胞侵入损伤区内进行增殖、分化，与宿主细胞良好融合。
1 材料与方法
1.1 神经干细胞球制备
取转录有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的孕16d SD鼠胚脑海马组织，按Wu方法\[1\]机械打碎成单细胞悬液，置于含有bFGF和N2(Sigma)的DMEM/F12(Gibco)培养液中体外培养3～5d，成为悬浮状神经干细胞球(neurosphere)。
1.2 脊髓损伤模型制备与干细胞移植
戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉后，在4周龄SD雄鼠胸8～9水平作椎板切开术，暴露脊髓，使用纽约大学设计的脊髓挫伤装置制造脊髓损伤模型(25g×50mm)。然后，在颅骨背侧中线钻一个直径1mm的小孔，将25μL培养的神经干细胞球悬液(约含1×106活细胞)缓慢注入损伤鼠第四脑室中。同时设立对照组，仅向脑室中注射等量干细胞，不损伤脊髓。
1.3 切片制备与免疫荧光染色
于干细胞移植后1、3、5、7、14、21d处死动物，按常规方法用40g/L多聚甲醛灌注固定，获取脑、脊髓组织。每个时间段取6个标本，冷冻切成超薄切片，进行免疫组化染色。一抗分别为：抗神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilaryacidic protein, GFAP)(1∶200，Sigma)；抗巢蛋白(Nestin)(1∶200, Pharmingen, SanDiego, CA)；抗微管蛋白(Tubulin)Ⅲ(1∶300, Sigma)；抗Rip(1∶300, Developmental Studies Hybridoma Bank IA惠赠)。4℃孵化过夜。二抗 (fragmentconjugated goat antimouse antibody, 1∶1000，Moleculat Probes, Eugene, OR)，孵化过夜，共聚焦激光显微镜(Radiance 2000；BioRad，UK)观察。
1.4 过氧化物酶免疫组化染色
①处死动物，完整获取脑、脊髓组织。②0.5%(体积分数)H2O2甲醛溶液浸泡10min，去除内源性过氧化物酶。 ③分别用含1g/L聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X100，Sigma)和1mL/L小牛血清溶液对标本进行免疫阻断。④分别加入一抗(鼠抗GFP，1∶400, Chemicon International, Temecula, CA)，二抗 (羊抗鼠IgG，1∶100，MBL，Nagoya，Japan)，各自4℃孵化12h。⑤ 放入含有1mL/L戊二醛的PBS固定10min。⑥0.5g/L二氨基联苯氨 (diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB, DojinDo, Japan)溶液和0.1%(体积分数)H2O2溶液中孵化5min，显影。解剖显微镜(CarI Zeiss，OPMIORL+S5，Germany)下观察DAB染色的脑、脊髓标本。
1.5 电镜标本制作与观察
标本制备成10μm的冰冻切片，按上述方法进行过氧化物酶免疫组化染色。DAB反应后切片用1g/L四氧化锇(OsO4)处理，酒精脱水处理，包埋于环氧树脂。超薄切片机(Ultrotome Ⅲ，LKB，Bromma，Sweden)将标本切成超薄切片和0.5μm的切片，分别用普通电镜(JEM 1200EX，JEOL，Akishima，Japan)和高压电镜(H125 M，Hitachi，Japan) 观察移植细胞。
1.6 DAB染色标本上的细胞团计量
分两次用2.4倍解剖显微镜对DAB染色后的脑、脊髓组织表面和脑组织的不同切面进行观察、计量。先忽略细胞团体积大小，仅计数其个数，取两次平均值作为每个脊髓细胞团个数，并以任意4个脊髓表面细胞团计数的平均值作为每个时间段的平均值。然后，拍摄DAB染色全段脊髓照片，用NIH软件(Image1.61)测算移植细胞团在脊髓表面所占的表面积。数据做配对t检验处理。
2 结果
2.1 移植细胞在脊髓表面的分布
从移植后第一天起即可见大量DAB染色呈黑色的微小斑点广泛散布于脊髓表面，且大多集中在颈胸段。移植细胞在脊髓表面形成的细胞团由术后第一天针尖大小逐渐增大到3周时背侧1.2mm×0.8mm，腹侧1.8mm×1.2mm大小，分布也由颈、胸段扩展到损伤区头侧。不同时段脊髓背、腹侧移植细胞团的数目存在明显的差别(P< 0.01，图1)。细胞团面积背侧小于腹侧；数目背侧多于腹侧，并于术后5d达到高峰，以后随着邻近细胞团的相互融合，数目逐渐减少。移植细胞的这种分布和增殖形式不仅见于无损伤的脊髓(对照组)，也见于损伤脊髓的正常部分，但很少见于脊髓损伤区尾侧。
2.2 移植细胞在损伤脊髓组织的表现
免疫荧光染色结果显示,脊髓严重挫伤造成几乎全部灰质和大部分背侧白质坏死、液化，形成一个巨大腔隙，腹侧仅有一小部分白质残留。损伤处头侧有大量GFAP染色阳性的细胞团附着在脊髓表面，而损伤处尾侧却极少见到移植细胞。1周时一些移植细胞侵入并融合于脊髓损伤区，多数细胞表达为GFAP阳性，少数为巢蛋白阳性，无细胞呈现Rip和Tubulin阳性。2～3周时移植细胞与宿主细胞良好融合(图2)。
2.3 移植细胞的分布特点
多数移植细胞聚集于脊髓表面的血管周围，沿血管长轴伸出突起。沿血管排列的细胞团明显大于远离血管者。脊髓前动脉和脊髓前正中裂内也发现有移植细胞团。免疫电镜显示在未损伤区移植细胞紧贴于软脊膜外表面，未进入脊髓实质(图3)。
2.4 移植细胞在脑组织的表现
与脊髓表面大量分布的移植细胞团相比，脑组织表面和脑室腔内DAB染色阳性细胞团明显偏少，呈散在性分布，附着于软脑膜和室管膜上，未能侵入脑组织内,部分移植细胞表达GFAP阳性。脑组织中移植细胞团的体积随时间增大。
3 讨 论
本实验表明通过第四脑室注射，移植的神经干细胞经脑脊液能广泛分布于脊髓表面，不断增殖。对于损伤脊髓来说，贴附于脊髓表面的部分移植干细胞能迁移、融合到损伤组织中,分化为神经胶质细胞。因此，通过脑脊液注射细胞对于损伤性脊髓进行干细胞移植是一种实用、有效的方法。
神经干细胞在由脑室进入脊髓蛛网膜下腔过程中，随脑脊液漂流向下散布于全段软脊膜上，增殖形成肉眼可见的微小细胞团，然后进一步融合成更大的团块。本实验表现出的移植干细胞在脊髓表面的高生存性和高增殖性说明，脑脊液能够为移植细胞提供生存和增殖的适宜环境。细胞分化方面，海马来源的干细胞在脊髓损伤区通常分化为星形细胞，很少分化成为少突胶质细胞\[1,5,6\]。虽有报道微环境对移植细胞分化有影响\[7,8\]，但究竟何种因素参与这种影响目前尚难以确定。
移植干细胞团块聚集于血管周围可能与易从血管中获取营养，有利于移植细胞增殖有关。而移植细胞团在脊髓背、腹侧分布上的差异可能与血管密度和实验鼠生活体位相关。
电镜照片显示干细胞及其突起均位于血管周围的结缔组织中。至少本实验中未发现有神经干细胞通过软脑膜、脊膜和室管膜侵入完整无损的神经组织中。提示这些被膜的天然屏障作用是有效的,同时也说明此种神经干细胞在移植早期不具备穿透正常软脑膜、脊膜的能力，不会侵入相应部位的脑、脊髓组织中。但这种干细胞中、长期是否仍能存留于软脑膜、脊膜外，不对非损伤区神经组织产生影响尚需后续实验验证。
损伤处蛛网膜与周围组织的粘连，阻碍脑脊液的正常循环和干细胞的沉降，可能是移植细胞主要分布于脊髓损伤的头侧，少见于尾侧的原因之一。这种粘连表现在处死动物，获取脊髓标本时能明显观察到，而且粘连的程度与脊髓损伤程度、脊髓表面有无出血、血肿和术后炎性反应时间相关。实验的结果表明，粘连不但影响了干细胞在尾侧的分布，也减少了干细胞在损伤区表面的分布量。只有增加干细胞在损伤区表面的积聚量，才有可能增加进入损伤区内的移植细胞量，并最终取得良好的效果。因此，如何减轻炎性粘连也将是今后实验及临床工作中面临的一个问题。
虽然本实验移植细胞在脑室中的表现与高英茂等\[9\]的结果相似，但移植细胞在脑、脊髓组织中的分布却相差甚远。这种差异性除了与脊髓损伤区释放的炎性因子的趋化作用相关外，是否有其他因素的影响尚不得而知。但向损伤区聚集的现象有利于在脊髓局部形成高密度的移植细胞区，为进一步分化和参与损伤组织的修复、再生创造了条件。
损伤区局部直接注射细胞很难使细胞存留在注射区内，常常由于注射后局部压力过高致使注射进去的细胞又从注射点溢出。因此，细胞移植的效果差别很大。另外，局部注射不仅需要外科手段的协助，而且注射本身也会造成脊髓组织的再损伤。与局部注射的不利因素相比，通过脑脊液移植细胞有其优势：①移植细胞通过脑脊液可广泛分布于脊髓表面，在宿主蛛网膜下腔中保持贴附、增殖和分化的能力，并有少量细胞侵入损伤区，表现出一定增殖能力。②临床上可通过脑室池注射和脊髓蛛网膜下腔穿刺使移植细胞进入脑脊液，实现移植细胞在损伤脊髓段的贴附、增殖和分化。③通过脑脊液途径能使损伤区及其头侧聚集大量的移植细胞，并且至少在早期不会对非损伤的脑、脊髓组织产生影响。因此，通过脑脊液向中枢神经系统病变进行神经干细胞移植是一种简便、易行、损伤轻微的好方法，便于推广和大面积应用。
参考文献：
[1\]Wu SF, Suzuki Y, Kitada M, et al. Migration, integration, and differentiation of hippocampusderived neurosphere cells after transplantation into injured rat spinal cord \[J\]. Neurosci Lett, 2001, 312(3):173-176.
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[3\]Bajocchi G, Feldman SH, Crystal RG, et al. Direct in vivo gene transfer to ependymal cells in the central nervous system using recombinant adenovirus vectors \[J\]. Nat Genet, 1993, 3(3):229-234.
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[5\]Wu SF, Suzuki Y, Kitada M, et al. New method for transplantation of neurosphere cells into injured spinal cord through cerebrospinal fluid in rat \[J\]. Neurosci Lett, 2002, 318(2):81-84.
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[8\]Shihabuddin LS, Horner PJ, Ray J, et al. Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus \[J\]. J Neurosci, 2000, 20(23):8727-8735.
[9\]高英茂，孙晋浩，杨琳，等. 大鼠胚胎神经上皮细胞侧脑室移植后存活及分化的实验研究 \[J\]. 解剖学报, 2002, 33(5):475-477.
作者简介：柏宏亮(1964)，男(汉族)，副教授，在读博士. Tel:(029)85323651; Email: bai4@163.net
(1. 西安交通大学第一医院整形激光医学美容中心，陕西西安710061；2. 浙江省人民医院整形外科，浙江杭州310014；3.日本京都大学附属医院形成外科，日本京都6068507)
(编辑韩维栋)
收稿日期：20050110
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