大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记
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摘要：目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法，检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法 应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs，贴壁法不断纯化，流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达，然后用pEGFPN3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs，荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形，有聚集生长的倾向，多3～5个细胞成为一个集落。传代后，细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大；②GFP转染后24h即可见绿色荧光蛋白表达，72h表达最强，此后逐渐减弱，到4周时仍可见少量表达；③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关，1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs；GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。
关键词：大鼠；骨髓间充质干细胞；培养；绿色荧光蛋白；转染
Rat mesenchymal stem cells culture and label with
green fluorescent protein gene transfectionWang Tingzhong, Ma Aiqun, Jiang Wenhui, Xu Zhengyun, Xi Yutao
(Department of Cardiology, First Hospital of Xi an Jiaotong University, Key Laboratory of
Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Xian 710061, China)ABSTRACT: ObjectiveTo establish a method of isolation and culture of the rat mesenchymal stem cells (MSCs), and to investigate the transient expression of green fluorescent protein gene transfection into MSCs. Methods MSCs, which were initially isolated from the bone marrow of rats, were cultured in vitro and tested by flow cytomertry. Then they were transfected with pEGFPN3 by means of Lipofectamine 2000. The ratio of plasmid to Lipofectamine varied according to the experiment design. The results of the transient expression of GFP and transfection efficiency were observed by fluorescence microscope. Results MSCs were adherent, elongated, and spindleshaped in the primary culture after 24 hours of plating, and then became several little clones; During mitosis the cells regained a rounded appearance, and remained loosely attached until division was completed. When they reached 80% confluence, MSCs were subcultured and gained uniform shape and similar growth pattern. The expression of GFP began at 24 hours after transfection, and reached the peak at 72 hours and decreased in 1 week; however, the transient expression remained for more than 4 weeks. Transfection efficiency was correlated with the ratio of plasmid to lipofectamine. Conclusion High pured MSCs can be obtained by Percoll gradient centrifuging and adherent method. GFP transfection is a better method to label MSCs.
KEY WORDS: rat; mesenchymal stem cell; culture; green fluorescent protein; transfection
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于骨髓基质中，是由Friedenstein最初在骨髓培养中发现的一种容易贴壁的纺锤状细胞\[1\]。此后又陆续发现MSCs具有多向分化潜能，在一定条件下，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等\[2-5\]。由于其良好的可塑性和不涉及伦理争议，MSCs成为组织工程和细胞治疗的最佳种子细胞，同时也是基因治疗较为理想的靶细胞。我们应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs，然后用带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的质粒pEGFPN3转染MSCs，检测其瞬时表达及转染效率，为进一步应用MSCs奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
60g左右雄性SD大鼠(由西安交通大学医学院实验动物中心提供)，pEGFPN3(Clontech公司)，大肠杆菌DH5α(由本室保存)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，质粒中量提取试剂盒(QIAGEN公司)，低糖型DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Percoll细胞分离液(Pharmacia公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，小鼠抗大鼠CD71RPE、CD90TRITC抗体(Oxford Biotechnology公司)，小鼠抗大鼠CD34PE抗体(SANTA CRUZ公司)， BamHⅠ、DNA Marker(MBI Fermentas公司)，CO2恒温培养箱(Heraeus公司)，荧光倒置显微镜(IX70型，OLYMPUS公司)。
1.2 大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化
利用CaCl2法制作大肠杆菌DH5α感受态并用pEGFPN3转化。
1.3 质粒的提取及鉴定
按照QIAGEN质粒中量提取试剂盒操作说明书提取质粒DNA，经BamHⅠ酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。紫外分光光度仪测定A260∶A280= 1.8，质粒浓度约为0.4g/L。
1.4 MSCs分离及原代培养
取60g左右雄性大鼠，击头处死，无菌条件下剪取四肢骨骼，用DMEM反复冲洗大鼠四肢骨髓腔，然后经200目不锈钢滤网过滤，将滤液充分吹打混匀后，贴壁缓慢加入离心管内盛有等体积的Percolls(密度1.073g/mL)液上。2400r/min离心20min，可见上下两层分界线有1～2mm的白色条带(单个核细胞)，小心吸取中间层细胞置于另一离心管中，PBS再清洗2次，沉淀的细胞加入DMEM培养液(含有100mL/L FBS，100u/mL青霉素，100u/mL链霉素)中，以5×105/mL接种于培养瓶中，放在37℃的5%(体积分数)CO2培养箱中孵育。24h后更换培养基，以后每3～4d换液1次，并用倒置显微镜观察拍照。待细胞长满瓶底的80%或接近融合(约12～14d)时传代。
1.5 MSCs的传代培养
当细胞长满瓶底或接近于80%～90%融合时，倒出培养基，用PBS液冲洗2遍，再加入2.5g/L的胰蛋白酶消化3min，直到细胞回缩成圆形，倒掉胰蛋白酶，向培养瓶中加入10mL DMEM(100u/mL青霉素，100u/mL链霉素)培养基，吸管吹打，待细胞从瓶壁上脱落后，平均分为两瓶，按100mL/L比例各加入新鲜的FBS，进行传代培养。
1.6 传代MSCs表面CD34、CD71和CD90表达情况的检测
分别将传2代和3代的大鼠MSCs(90%汇合)，用2.5g/L胰酶消化后，1200r/min离心5min，弃上清，用PBS液洗涤制成2.0×106个MSCs的单细胞悬液。然后加入6个离心管中，其中1管为空白对照，3管为补偿管，2管为实验管，补偿管中分别加入CD34PE、CD71PE和CD90FITC各10μL，实验管1中分别加入CD34PE和CD90FITC各10μL，实验管2中分别加入CD71PE和CD90FITC各10μL，室温孵育20min。PBS洗涤，1200r/min离心5min，再重复1次。每管中加入500μL 40g/L多聚甲醛，流式细胞仪检测。
1.7 GFP基因转染
将2代细胞传代至12孔板内。待细胞长至80%融合时，选取8个孔进行基因转染，其余4孔为空白对照。将pEGFPN3分为2、4、6、8μL 4个剂量，Lipofectamine 2000分为4μL和8μL 2个剂量，交叉组合后转染各孔细胞。对于每孔细胞，分别用100μL无血清DMEM培养基稀释质粒pEGFPN3，再用100μL无血清DMEM培养基稀释Lipofectamine 2000，然后在5min内将二者混合，轻柔摇动，室温放置30min后，加入1.5mL无血清DMEM培养基，轻柔摇动。空白对照组只加入DMEM培养基200μL，不加质粒pEGFPN3和脂质体Lipofectamine 2000。然后吸尽培养板中的培养液，用无血清DMEM培养基洗涤1次，然后将质粒脂质体复合物滴加到细胞表面，置37℃培养箱中培养。5h后，吸尽培养液，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，置37℃培养箱中培养。
1.8 转染后GFP的表达
分别在转染后24h、72h、3d、1周、2周、3周和4周，在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达。
2 结果
2.1 质粒酶切鉴定结果
提取质粒经BamHⅠ酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳显示为清晰单一条带，约4.7kb，确定所提质粒为pEGFPN3(图1)。
2.2 MSCs的形态和状态
原代细胞接种24h后，培养瓶底即出现少许贴壁细胞，多呈纺锤形或梭形，有少量细胞已开始增殖，呈成纤维细胞样，有聚集生长的倾向，多3～5个细胞成为一个集落，少有单个分散状态。随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多，集落逐渐增大，呈放射状排列(图2A)。10d左右，90%以上的细胞呈成纤维细胞样，胞体膨大，伸出长短不一、粗细不均的多种形态胞浆突起，胞核大，核轮廓不清，核仁清晰可见。12～14d左右，细胞融合成单层。传代后，细胞分布均匀，生长也趋一致。细胞呈典型的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大(图2B)。传代细胞增殖速度明显加快，周期为7d左右。
2.3 传代MSCs表面CD34、CD71和CD90表达情况
传2代骨髓间充质干细胞表达CD90，不表达CD34和CD71(表1)。随着传代次数增加，细胞仍表达CD90，不表达CD34，但开始表达CD71。表1 大鼠MSCs CD34、CD71和CD90的表达
2.4 转染后GFP表达情况
转染后24h即可见发绿色荧光的细胞(图3A、B)。48～72h阳性细胞逐渐增多，强度增强，多为明亮的绿色荧光(图3C)，转染效率约30%左右。1周后表达绿色荧光的细胞逐渐减少，荧光逐渐减弱，到4周时，仍可见散在的荧光(图3D)。空白对照组未见荧光表达。
3 讨 论
目前，对于大鼠骨髓中MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法，比较常用的方法是贴壁细胞分离法\[1\]、密度梯度离心法\[6\]、流式细胞仪\[7\]和免疫磁珠分离法\[8\]。单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，而且实验条件要求高，需要骨髓量大，从一个部位每次抽取骨髓的量不应超过2mL，否则将因吸出物中血量的增加引起有核细胞数明显减少。贴壁细胞分离法是根据骨髓MSCs贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离，但所得的细胞成分复杂，骨髓MSCs的纯度不足。
因此，实验中我们把密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，根据比重差别，用比重为1.073g/mL的Percoll细胞分离液分离骨髓MSCs，经梯度离心后，能有效的将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去，获得纯度较高的单个核细胞。然后根据MSCs与造血系细胞贴壁性能差异，经体外贴壁培养，随着换液弃除悬浮生长的血细胞，进而获得较纯的MSCs。经几次传代，细胞变为形态更均一，排列更有序的成纤维细胞样。这提示对MSCs作传代有益于纯化MSCs。为了提高细胞获取率，取材时要严格无菌，操作要快速。此外，换液不可太勤，除了细胞的生长需要一定的密度之外，细胞自分泌的一些物质也有助于其生长。
有关MSCs的表面标记，目前尚没有统一标准，但一般不表达CD34(造血干细胞特异性标志)，表达CD90(Thy1)\[6\]。这与我们的实验结果一致。CD71又称转铁蛋白受体，主要参与铁代谢和细胞生长，仅有微弱表达，说明我们所分离培养的细胞是区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干细胞。这与侯玲玲等的实验结果一致\[9\]。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是来自于南太平洋水母的一种新型报告基因，具有特异性高，易于识别，容易在细胞内进行定位观察及对活细胞功能没有不良影响等优点\[10\]。其激发光波长为488nm，发射光波长为507nm。EGFP为其突变型，系将丝氨酸65用苏氨酸代替，苯丙氨酸64用亮氨酸代替，使其产生的荧光比野生型GFP强35倍，从而大大增强了该报告分子的灵敏度。
本研究的结果表明，GFP基因在转染骨髓MSCs后24h就能观察到绿色荧光，48～72h阳性细胞逐渐增多，强度增强，多为明亮的绿色荧光，转染效率约30%左右。1周后表达绿色荧光的细胞逐渐减少，荧光逐渐减弱，到4周时，仍可见散在的荧光。我们还观察到转染细胞与非转染细胞基本生物学特性没有变化。这说明GFP基因可作为一种高效的报告基因。为了能够成功转染，转染前一定要使细胞密度达到90%左右，采用无血清、无抗生素转染，质粒和脂质体浓度比例为1∶2到1∶3效果最佳。
利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法分离培养大鼠MSCs，然后用GFP转染标记，可以进一步进行以下研究：干细胞移植治疗研究；干细胞分化调控因素研究；作为基因治疗的载体。
参考文献：
[1\]Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues \[J\]. Transplantation, 1968, 6(2):230-247.
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[8\]Ratajczak MZ, Kuczynski WI, Sokol DL, et al. Expression and physiologic significance of Kit ligand and stem cell tyrosine kinase1 receptor ligand in normal human CD34+, cKit+ marrow cells \[J\]. Blood, 1995, 86(6):2161-2167.
[9\]侯玲玲, 曹华, 白慈贤, 等. 人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究 \[J\]. 自然科学进展, 2002,12(3):277-281.
[10\]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression \[J\]. Science, 1994, 263(5148):802-805.
通讯作者：马爱群, Tel: (029)85261809; Email: maaiqun@medmail.com.cn
作者简介：王亭忠(1977)，男(汉族)，博士研究生，住院医师. 研究方向：干细胞向心肌细胞的分化. Tel: (029)85274729; Email: wangtz9603@sohu.com
(西安交通大学第一医院心内科；教育部环境与疾病相关基因重点实验室，陕西西安710061)
(编辑韩维栋)
收稿日期：20041128
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