粘着斑激酶在TF／Ⅶa介导的乳腺癌细胞粘附、迁移中的作用
 |
| 第1页 |
参见附件(238KB，3页)。
摘要：目的 研究粘着斑激酶(FAK)磷酸化在凝血因子Ⅶa与组织因子(TF)结合引起的乳腺癌细胞粘附、迁移中的作用，探讨TF促肿瘤转移的机制。方法 用比色法测定凝血因子Ⅶa与高表达TF的乳腺癌MDAMB231细胞的粘附数目；采用改良Bodyen 小室检测肿瘤细胞迁移；免疫沉淀和Western blot 方法检测FAK 及其磷酸化。结果 凝血因子Ⅶ a与TF结合引起FAK磷酸化，参与肿瘤细胞迁移运动。结论 FAK是TF介导的乳腺癌细胞粘附、迁移中的重要信号分子。
关键词：粘着斑激酶；组织因子；粘附；迁移
The role of focal adhesion kinase in the breast carcinoma s adhesion and
migration mediated by the coagulation factor Ⅶa/tissue factor
Guo Yanli, Wei Wenning, Song Shanjun
(Institute of Hematology, Union Hospital Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China)
ABSTRACT: Objective To study the role of focal adhesion kinase in the breast carcinoma cell adhesion and migration mediated by coagulation factor Ⅶa combined with tissue factor to explore the mechanism of tissue factor promoting metastasis. Methods The count of adherent cells were detected by using colorimetric assay, cell migration was detected with modified Bodyen chamber, and the FAK and the tyrosine phosphorylation of FAK were detected by immunoprecipitation and Western blot. Results Factor Ⅶa combinaed with tissue factor induced the tyrosine phosphorylation of FAK, which took part in the cancer cells migration. Conclusion FAK is an important message of the breast carcinomas adhesion and migration mediated by TF.
KEY WORDS: focal adhesion kinase; tissue factor; adhesion; migration
组织因子(tissue factor, TF)是凝血过程中重要的启动因子。近年来研究发现TF在肿瘤的血管生成、生长、转移中亦发挥重要作用，与肿瘤细胞的转移能力呈高度正相关。因此探讨TF参与肿瘤侵袭、转移的机制成为关注的热点 \[1,2\]。细胞生物学研究表明，粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK) 与细胞的发育、生长、转化、凋亡及运动密切相关，许多研究发现FAK是传递肿瘤细胞运动、增殖、分化等信号的重要信号分子\[3\]。我们发现表达TF的乳腺癌MDAMB231细胞与凝血因子Ⅶa结合引起FAK磷酸化及细胞迁移，可能是TF参与肿瘤侵袭转移机制之一。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
含Ⅶa的标准血清(STAGO 公司)，AbTF(HTI 公司), 纤粘连蛋白(CHEMICON公司)，多聚赖氨酸(SIGMA 公司)，兔抗人的多克隆抗体FAK、酪氨酸磷酸化抗体PY20(NEWMARKER 公司)，碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG(北京中山公司)，改良Bodyen chamber(CORNING公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
乳腺癌细胞系MDAMB231引自武汉同济医院肿瘤生物治疗中心，以含10%(体积分数)小牛血清的1640培养基于37℃，5%(体积分数)CO2培养箱中培养。
1.2.2 细胞粘附实验
分别将10nmolⅦa、10mg/L纤粘连蛋白(fibronectin, FN)、10mg/L的多聚赖氨酸(polyLlysine)包被于96孔培养板孔底，4℃过夜，用10g/L牛血清白蛋白(BSA，用前灭活)对非特异性结合封闭。将无血清培养基培养过夜的细胞用0.25g/L胰酶/EDTA消化,用无血清的细胞培养基(含10g/L的BSA)重悬细胞，并在室温下静置30min后接种于细胞培养板(5×104个细胞/每孔)，37℃、5%(体积分数)CO2细胞培养箱中开盖孵育60min，轻轻洗掉未粘附的细胞。戊二醛固定，结晶紫染色，测定570nm吸光度值(A)，以A值来反映和定量细胞粘附数目。每组设3个复孔，取均值。
1.2.3 细胞迁移
采用改良Bodyen小室测定细胞迁移力(迁移细胞数代表迁移力)。硝酸纤维膜(孔径8μm)，分别包被50mg/L AbTF、10mg/L FN，在上室中加入细胞悬液(5×104)，37℃ 5%(体积分数)CO2静置8h，将上室面未迁移的细胞刮除。甲醛固定，苏木素染色，在高倍镜下(×200)计数细胞。每组作3 次，取均值。
1.2.4 免疫沉淀和免疫印迹法检测FAK及其磷酸化
将细胞(5×106)接种于直径为60mm分别包被有Ⅶa(10nmol)、FN(10mg/L)、多聚赖氨酸(10mg/L)的细胞培养皿中，孵箱内37℃ 5%(体积分数)CO2静置1h后弃去培养液，轻轻洗掉未粘附的细胞。用冰PBS(pH7.2)清洗细胞,加入预冷的0.25mL RIPA细胞裂解缓冲液(1× PBS，10g/L NP40，10g/L脱氧胆酸钠，10g/L SDS，100mg/L PMSF，10g/L Aprotinin，50mmol NaF)，冰置30min后刮起细胞，连同裂解液移置EP管中，4℃、12000r/min 离心20min，取上清分装，取适量稀释后进行蛋白定量，部分存于-80℃。取30μg 蛋白加入上样缓冲液，100℃加热3min 后进行SDSPAGE 分离(分离胶浓度为80g/L)，转膜，转膜后用50g/L脱脂奶粉封闭 ，4℃过夜，接着加稀释度为1∶200的兔抗FAK的多克隆抗体杂交(4℃ )12h以上，加入二抗(碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG)，最后加入碱性磷酸酶的可催化底物BCIP/NBT(5溴4氯3吲哚磷酸/氮兰四唑)，观察显色反应，并拍照。另取100μg总蛋白，加入10μg PY20 抗体，4℃反应1h，然后加入50μL蛋白A Sepharose 进行沉淀，用裂解缓冲液洗3 次，加入上样缓冲液，100℃加热3min进行SDSPAGE，转膜，1∶200的兔抗FAK的多克隆抗体杂交，加入1∶2000碱性磷酸酶偶联的二抗，与碱性磷酸酶的可催化底物BCIP/NBT 结合显色，拍照。
1.2.5 统计学处理
数据用±s表示。使用SPSS11.0软件对细胞粘附实验数据作单因素方差分析；细胞迁移试验数据采用t检验。P<0.05为有统计学意义。
〖2〗西安交通大学学报(医学版)〖3〗第26卷5期〖2〗郭艳丽，魏文宁，宋善俊. 粘着斑激酶在TF/Ⅶa介导的乳腺癌细胞粘附、迁移中的作用
2 结 果
2.1 细胞粘附
测定细胞在570nm处的吸光度值(A)来定量细胞粘附的数目。细胞与多聚赖氨酸粘附数目(A)为0.48267±0.0094 ，与FN粘附的数目为0.4733±0.0152，与Ⅶa粘附的数目0.4570±0.0075。经单因素方差分析，细胞与各粘附分子粘附的细胞数无显著性差异(P>0.05，图1)。
2.2 细胞迁移
通过计数穿膜细胞数的多少作为评价肿瘤细胞迁移力的指标。细胞穿过分别包被有FN、AbTF的硝酸纤维膜的平均细胞数分别为(199±15)个和(205±13)个，无统计学差异(P>0.05)。
2.3 免疫沉淀和免疫印迹结果
可见细胞与 Ⅶa、FN的结合作用，激活了FAK，使其发生酪氨酸磷酸化，而多聚赖氨酸只借其表面正电荷与细胞表面负电荷结合粘附，不能激活 FAK(图2、3 ) 。
3 讨 论
TF是凝血因子中唯一在细胞表面表达的I型跨膜糖蛋白。近期研究TF的受体功能提示它在信号传导中发挥作用。TF与其自然配体凝血因子Ⅶa结合诱发了一系列细胞内信号的传递，如细胞内钙、Src激酶、MAPK 、Rac等的激活及p70/p85S6K、p90RSK蛋白的磷酸化，从而引起细胞内一些靶基因如cfos，cmyc的活化，最终改变和影响细胞的运动、生长、分化和凋亡\[2,4,5\] 。国外研究报道，表达TF 的J82 膀胱癌细胞与重组FⅦa或抗TF抗体结合后, 其胞内区与细胞骨架系统的重要成分肌动蛋白结合蛋白280 (ABP280) 相互作用,引起细胞骨架肌动蛋白网络重组，诱导细胞内FAK磷酸化，参与细胞迁移\[6\]。
肿瘤侵袭基底膜是转移的起始步骤，其中癌细胞与其周围间质和基底膜成分的粘附是第一步；在癌细胞侵入血管后再游出血管的过程中，癌细胞与血管内皮及其下的基底膜异质粘附也是转移过程的关键步骤。可见粘附在癌细胞的侵袭、转移过程中的重要作用。在本研究中我们使用高表达TF的MDAMB231细胞与FⅦa结合(粘附)，诱导了FAK磷酸化；使用FN作为对照(与细胞表面整合素结合)，同样出现了粘附、伸展和FAK磷酸化，但细胞伸展形态有所不同，可能与涉及的细胞内骨架蛋白不同有关。而多聚赖氨酸只是通过其表面的正电荷与细胞表面负电荷结合粘附，未见到细胞伸展、FAK磷酸化和细胞迁移运动。
FAK是分子质量为125ku的非受体蛋白酪氨酸激酶,许多外界刺激如生长因子、神经肽、G蛋白偶连的受体激动剂以及机械刺激均可诱导FAK酪氨酸磷酸化。FAK的主要调节方式是依赖整合素与细胞外基质的粘附，是整合素信号途径中的组成成分并发挥关键作用\[7\]。本研究中乳腺癌细胞与胞外基质成分FN发生粘附后诱导FAK的激活和细胞迁移，从侧面证实了FAK在整合素信号中的作用。
本研究在国内首次报道以乳腺癌MDAMB231细胞为实验对象，以TF作为信号传递的受体，与天然配体Ⅶa结合，激活FAK引起细胞迁移运动 \[6\]。这不仅为阐明TF在肿瘤转移中的作用机制提供了依据，而且也为更深入地探讨TF在肿瘤转移机制中的作用提供了新的研究方向。本文欠缺之处是没有探讨FAK激活的下游信号分子及相关基因转录的变化。 TF作为受体活化FAK，是否与整合素介导的FAK激活有不同之处，有待进一步研究。
参考文献：
[1\]方峻，宋善俊. 活化的血液凝固因子Ⅶa和组织因子复合物介导信号传导与肿瘤生长、浸润及转移 \[J\]. 中华血液学杂志, 2002,23(5):279-280.
[2\]方峻，宋善俊. 组织因子的非凝血功能 \[J\]. 中华血液学杂志, 2004, 25(3):184-186.
[3\]Parsons JT, Martin KH, Slack JK, et al. Focal adhesion kinase: a regulator of focal adhesion dynamics and cell movement \[J\]. Oncogene, 2000,19(49):5606-5613.
[4\]Versteeg HH, Peppelenbosch MP, Spek CA. The pleiotropic effects of tissue factor: a possible role for factor Ⅶainduced intracellular signalling \[J\]. Thromb Haemost, 2001,86(6):1353-1359.
[5\]Versteeg HH, Sorensen BB, Slofstra SH, et al. Ⅶa/Tissue factor interaction results in a tissue factor cytoplasmic domainindependent activation of protein synthesis, p70, and p90 S6 kinase phosphorylation \[J\]. J Biol Chem, 2002, 277(30):27065-27072.
[6\]Ott I, Fischer EG, Miyagi Y, et al. A role for tissue factor in cell adhesion and migration mediated by interaction with actin binding protein 280 \[J\]. J Cell Biol,1998,140(5):1241-1253.
[7\]Schaller MD. Biochemical signals and biological responses elicited by the focal adhesion kinase \[J\]. Biochim Biophys Acta, 2001,1540(1):1-21.
通讯作者：宋善俊，Tel: (027)85726916
作者简介：郭艳丽(1973 ) 女，(汉族)，在读博士. 研究方向：止血与血栓. Email: guoyanli1973@126.com
(华中科技大学同济医学院附属协和医院血研所，湖北武汉430022 )
(编辑 卓选鹏)
收稿日期：20041223
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(238KB，3页)。