Ｔｅｎａｓｃｉｎ、ＣＤ34在胆管癌组织中的表达及临床意义
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摘要：目的 探讨Tenascin、CD34在胆管癌的发生、发展中的作用和意义。方法 收集我院1995年-2003年期间切除的胆管癌标本33例和正常胆管组织4例，采用免疫组织化学SP方法，检测其Tenascin、CD34的表达情况。结果 Tenascin在胆管癌组织中的阳性表达率为81.8%(27/33)，其中病理分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的阳性率分别为71.4%、82.4%和88.9%，但无显著性统计学差异(P>0.05)；在正常胆管组织中未检测到Tenascin表达。CD34 在胆管癌组织中广泛表达，在正常胆管组织中仅有少量表达，两者相比具有显著统计学差异(P<0.05)。结论 Tenascin可以作为胆管癌的肿瘤标志应用于临床诊断， CD34可作为预测肿瘤转移的一项重要指标。
关键词：胆管癌；Tenascin；CD34；免疫组织化学
Expression and clinical significance of tenascin and CD34 in human cholangiocarcinoma
Wang Lin, Dong Xiaogang, Yao Jun
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Medical School of
Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objecive To investigate the role of tenascin and CD34 in occurence and development of cholangiocarcinoma. Methods The expression of tenascin and CD34 were examined in 33 patients, 16 males, 17 femalse, ranged 32-70 years with cholangiocancinoma and in 4 cases of normal bile duct tissue by SP immunohisto chemical technique. Results TN expression was located in the stroma of cholangiocarcinoma. The proportion of positive TN expression was 81.8%(27/33). The positive rate of pathologic grade Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were 71.4%, 82.4% and 88.9%, respectively. There was no significant difference among the three graded groups. TN expression wasnt detected in normal tissues (P>0.05). CD34 showed widespread expression in cholangiocarcinoma tissues, but limited in normal bile duct, which showed significant difference (P<0.05). Conclusion TN was over expressed in cholangiocarcinoma compared with negative expression in normal tissues, which suggested the diagnostic value of TN for cholangiocarcinoma. The levels of MVD marked by CD34 were significantly higher in cholangiocarcinoma than that in normal tissue. Whats more, there were significant correlation between MVD and pathologic grades and/or metastasis.
KEY WORDS: cholangiocarcinoma; tenascin; CD34; immunohistochemistry
胆管癌是较常见的恶性肿瘤之一，具有诊断困难、恶性度高、转移早、预后差等特点。近年来，人们发现细胞外基质(extracellular matrix, ECM)与肿瘤生长转移关系密切。Tenascin(TN)是细胞外基质中一种具有独特六臂体结构的高分子糖蛋白\[1\]，在成熟组织中不表达或仅有少量表达。近来研究表明，TN在许多人类恶性肿瘤组织中有较高表达\[2-3\]，且其表达与肿瘤病理分级和肿瘤血管生成关系密切。 CD34 为目前公认较敏感的血管标记物，具有染色强、背景清晰易计数等优点，通过对其进行免疫组化染色，可以检测肿瘤组织微血管密度(microvascular denstity, MVD)，故MVD值可代表CD34的表达情况，从而定量的反映出肿瘤微血管增生情况。TN 和CD34 在肿瘤组织中表达的联合研究将有助于进一步了解TN的作用，为肿瘤的诊断治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集本院1995年-2003年期间切除的胆管癌组织标本33例，其中男16例，女17例，男女人数之比为0.94∶1；年龄32-70岁(平均58.42岁)，其中≥60岁的患者占60.61% ，术前均未经任何治疗。标本均经病理证实为腺癌，组织学分级：Ⅰ级7例(21.2%)，Ⅱ级17例(51.5%)，Ⅲ级9例(27.3%)。
1.2 主要试剂 鼠抗人TN、CD34单克隆抗体(即用型)、免疫组化UltraSensitive SP超敏试剂盒(兔抗鼠，即用型)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂，均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.3 免疫组化染色 应用免疫组织化学SP染色技术，检测TN 及CD34 在33 例胆管癌组织标本中的表达。已知乳腺癌标本作为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，4例正常胆管组织标本作正常组织对照。
1.4 结果判定标准 细胞外基质有特异性棕黄色染色判定为TN阳性。TN 染色分布于细胞外基质局部，未形成明显的条索状判定为(+)；TN在基质中大量表达，形成明显的条索状及网格状判定为()。CD34 染色判定参考Weidner 微血管计量方法， 即每一个染成棕黄色的，可与周围血管、肿瘤细胞和其他结缔组织区分开的内皮细胞或内皮细胞簇，不论管腔和红细胞出现与否，均作为一个单一的、可计数的微血管。先于低倍光镜(×100)下确定3 个血管着色最密集的区域，然后在高倍视野(×400)内计数微血管的数目，取3 个视野的均值，四舍五入后作为MVD。分辨不清或染色模糊的细胞不计数；管腔面积>8个红细胞直径，带有较厚的肌层的微血管亦不计数。在双盲法下进行，每张切片由两人分别判定计数，两人计数相差10%以上者重新计数。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0软件包进行统计分析。TN与临床病理特征之间使用非参数秩和检验；MVD与胆管癌临床病理特征及与TN表达之间关系的分析，在两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以α=0.05作为检验水准。
2 结果
2.1 TN在正常胆管组织及胆管癌组织中的表达 在4例正常胆管组织中，TN 均阴性表达(图1A)；在胆管癌组织中TN 阳性表达率为 81.8%(27/33)，其中(+)占36.4%(12/33)，()占45.5%(15/33)，余均为阴性(图1B-D)。
图1 TN在正常胆管组织及胆管癌组织中表达(略)
Fig.1 The expression of TN in normal bile duct and cholangiocarcinoma tissues
A: negative expression in normal bile duct tissues (SP×400)
B: positive expression of pathologic grade Ⅲ(TN expression was located in the stroma of cholangiocarcinoma. It appeared yellowish thick bands or reticula) (SP×400)
C: positive expression of pathologic grade Ⅰ(TN expression also appeared yellowish bands or reticula, but the positive rate is less) (SP×400)
D: positive expression of TN in vessel wall of cholangiocarcinoma tissues (SP×200)
2.2 CD34在正常胆管组织及胆管癌组织中的表达 在正常胆管组织中，CD34表达较少，MVD为11.50±3.11(图2A)；而在胆管癌组织中微血管大量出现，MVD为60.52±7.20(图2B)。两者存在极显著差异(P<0.001)。
2.3 MVD与胆管癌临床病理特征的关系 经计数，病理分级为Ⅰ级的癌组织中MVD为54.43±6.35，Ⅱ级为61.76±7.42，Ⅲ级为62.89±5.51。MVD与病理分级具有显著性的总体差异(P＝0.033)。进一步分析，Ⅰ级分别与Ⅱ、Ⅲ级比较有显著性差异(P<0.05)，而Ⅱ、Ⅲ级之间差异不明显(P>0.05)。同时MVD与病理分级具有正相关性(r＝0.394，P＝0.023)。
图2 CD34在正常胆管组织及胆管癌组织中表达(略)
Fig.2 The expression of CD34 in normal bile duct and cholangiocarcinoma tissues
A: limited expression of CD34 in normal bile duct tissues (SP×400)
B: CD34 showed sinusoid widespread expression in cholangiocarcinoma tissues (SP×200)
2.4 MVD与远处转移 本实验通过统计学分析发现，MVD与胆管癌发生远处转移也存在显著的相关性(r＝0.358，P<0.05)，但未发现与临床分期和肿瘤大小等病理特征有显著相关性。并且结果显示MVD<60时，转移率为12.5%；MVD≥60 时，转移率为35.3%。提示肿瘤血管生成越多，肿瘤越具有更强的侵袭转移能力。这与前面讨论的肿瘤恶性度越高，肿瘤血管生成越多的结果相一致。所以MVD可作为预测肿瘤转移的一项重要指标。
2.5 TN与MVD之间关系 本实验中还发现肿瘤基质中TN(-)表达的MVD 值为56.33±8.12，TN(+)表达的为57.92±5.70，TN()为64.27±6.42。TN与MVD之间表达具有显著性总体差异(P＝0.017)。进一步分析，TN(-)和(+)分别与()相比较，MVD具有显著性差异(P<0.05)；TN(-)与(+)相比较，MVD无显著性差异(P>0.05)。TN表达与MVD表达具有相关性(r＝0.464，P=0.007)。我们还发现TN不仅表达于基质和基底膜，而且血管壁上也有明显的表达。这一结论提示TN 表达与肿瘤血管生成即CD34关系密切。
3 讨论
胆管癌作为一种恶性程度较高的肿瘤，由于其解剖和生理特点使早期诊断较困难，而且预后不良。其治疗仍以手术治疗为主，但术后往往在短期内复发，这主要与胆管癌高度侵袭转移的特征有关。本实验正是要通过免疫组化方法，检测TN、CD34在正常胆管和胆管癌组织中的表达，分析其与胆管癌临床病理特征之间关系。
吴景文\[4\]指出TN在各级胶质瘤细胞均有表达，且随肿瘤细胞恶性度增高，TN 表达也越强。Iskaros等\[5\]研究乳腺癌时发现，TN表达与乳腺癌病理分级相关，而与肿瘤大小、转移没有相关性。这些研究均提示肿瘤组织中TN可能与肿瘤细胞增殖、粘附、迁移及肿瘤血管形成有关。本实验结果显示，TN在正常胆管组织中阴性表达；而在胆管癌组织阳性表达率为81.8%，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中阳性表达率分别为71.4%、82.4%和88.9%，阳性表达率呈上升趋势。
肿瘤是一种具有典型血管依赖性的特殊病变。血管生成是指在已存在的血管网的内皮细胞形成新血管的过程，它是肿瘤生长及转移的重要保障。若肿瘤血管的生成被阻断，肿瘤将发生坏死、凋亡或处于休眠状态，更不会发生转移。所以为了保持恶性肿瘤无限制浸润性生长，肿瘤必须依赖持续而广泛的血管生成。一般认为肿瘤血管生成是由许多血管生成因子和血管生成抑制因子共同作用的结果。在肿瘤发生过程中，周围环境与其基因的改变不仅可以增加血管生成因子，而且还可以减少血管生成抑制因子，从而触发肿瘤血管生成的“开关机制”\[6\]。环境因素包括缺氧、pH改变、代谢性应激和炎性因子等；基因改变则包括癌基因Src、Ras 的激活和抑癌基因的缺失，如P53和von HippelLindau 基因等。
CD34 是目前被认为较敏感的血管标记物，具有染色强、背景清晰易计数的优点。CD34在肝癌组织的阳性表达提示肝血窦内皮化，并可显示肿瘤内微血管的数量及密度\[7\]。通过对其进行免疫组化染色，得到肿瘤及正常组织的MVD，从而定量地反映出肿瘤微血管增生情况。MVD是表示肿瘤血管生成数量的有效指标，不仅可以反映肿瘤的营养状态，而且还反映出了肿瘤的浸润和转移情况。大多数学者认为MVD与乳腺癌的临床分期、组织学分级呈正相关性\[8\]。杨朝恒等\[9\]研究显示乳腺癌分期晚、分级差、有复发、腋淋巴转移阳性者,MVD显著增高。目前MVD也用于恶性黑色素瘤、前列腺癌等的预后判断，而在胆管癌组织中研究较少。本实验结果显示，MVD 与胆管癌发生远处转移也存在显著相关性(r＝0.358，P<0.05)，MVD<60 时，转移率为12.5%，MVD≥60 时，转移率为35.3%。这与Weidner 的实验结果大致相符。提示肿瘤血管生成越多，肿瘤越具有更强的侵袭转移能力。这亦与前面讨论的肿瘤恶性度越高，肿瘤血管生成越多的结果相一致。所以MVD(CD34)可作为预测肿瘤转移的一项重要指标。
可以相信，进一步研究TN不仅有助于对肿瘤侵袭转移认识的不断深入，而且也为胆管癌等恶性肿瘤的治疗提供一个极有前途的发展方向。
参考文献：
\[1\]Goepel C, Stoerer S, Koelbl H. Tenascin in preinvasive lesions of the vulva and vulvar cancer \[J\]. Anticancer Res, 2003,23(6c):45874591.
\[2\]Brunner A, Mayerl C, Tzankov A, et al. Prognostic significance of tenascinC expression in superficial and invasive bladder cancer \[J\]. J Clin Pathol, 2004,57:927-931.
\[3\]Atula T, Hedstrom J, Finne P, et al. TenascinC expression and its prognostic significance in oral and pharyngeal squamous cell carcinoma \[J\]. Anticancer Res, 2003, 23(3c):3051-3056.
\[4\]吴景文. 人脑胶质瘤Tenascin和CD34 表达与患者预后的相关性 \[J\]. 解放军医学杂志, 2002, 127(1):1516.
\[5\]Iskaros BF, Hu X, Sparano JA, et al. Tenascin pattern of expression and established prognostic factors in invasive breast carcinoma \[J\]. J Surg Oncol,1998, 68(2):107112.
\[6\]Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis \[J\]. Cell, 1996, 86(3):353364.
\[7\]陈永红，赵建业，陈志南，等. CD34在肝细胞癌血窦中的表达以及微血管密度与预后的关系 \[J\]. 中华病理学杂志, 2001, 30(3),239.
\[8\]赵士彭,赵发,郭伶俐,等. 肿瘤微血管密度研究进展 \[J\]. 国外医学外科学分册, 2001,28(1):2
\[9\]杨朝恒，贾光伟. 73例乳腺癌微血管密度检测临床分析 \[J\]. 中国临床医生, 2005,7(3):408.
(编辑 卓选鹏)
作者简介：王林(1961)，男(汉族)，副教授，硕士生导师. 研究方向：胆囊癌、胆道疾病.
(西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)
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